木瓜蛋白酶对蛋白质的水解具有较好的催化活性，但以游离酶的形式作用米糠，会存在易变性失活、反应条件不易控制等缺点，而将其进行固定化，不仅利于酶的分散和回收、增加循环使用次数还可提高稳定性。利用醋酸纤维素（CA）和聚四氟乙烯膜（PTFE）制成的CA-PTFE复合膜具有吸附性、化学稳定性和机械性能优异等特点，以此为载体固定化木瓜蛋白酶，不仅能使蛋白酶与底物快速分离，提高酶的重复利用率，降低生产成本，也实现了酶的催化功能和膜的分离、载体功能的有机结合。
东北农业大学食品学院于殿宇、陈书曼和秦兰霞*等人利用CA修饰PTFE制备了CA-PTFE复合膜，再以CA-PTFE复合膜为载体通过吸附交联法固定化木瓜蛋白酶，以复合膜固定化酶对米糠进行钝化处理，探究酶膜钝化米糠效果及工艺条件，考察酶膜的重复使用次数对酶活力的影响，研究钝化后米糠的贮存稳定性，为工业化连续生产提供一定的理论依据。
酶膜载酶量及酶活力测定
通过采用Bradford方法测定酶蛋白含量计算出单位面积酶膜的载酶量为0.75 mg/cm2，固定化酶膜的酶活力达到224.25 U/mg。虽然酶活力有所降低，但可增加重复利用次数，避免了酶的大量流失。
扫描电镜分析
从图1a可知，空白PTFE微孔膜内部呈纤维状，错乱交叉，排列不规则，开孔率比较高，其平均孔径为0.1 μm，有较大的空间负载酶，但这种结构表面平整光滑，不利于酶的固定化。图1b中CA-PTFE复合膜的表面平整、致密且均匀，这是由于经醋酸纤维素修饰后，聚四氟乙烯膜内部微孔被醋酸纤维素交织成网状结构，稳定性和生物兼容性得到提高，从而利于酶的固定。图1c中CA-PTFE复合膜表面大部被酶覆盖，且在表面分布均匀，表明大部分的酶被固定在CA-PTFE的界面上，这种结构较利于木瓜蛋白酶的固定化。
单因素试验结果分析
3.1 钝化时空气相对湿度对相对脂肪酶活力的影响
结果显示，随着操作室内空气相对湿度的增大，米糠相对脂肪酶活力呈先降低后平缓趋势，在50%的空气相对湿度下，脂肪酶相对酶活力最高为59.4%，当空气相对湿度大于80%时，相对酶活力的降低趋于平稳，，但是由于酶的催化作用只与少部分与酶结合的“结合水”有关，增大空气相对湿度后，过高的水分含量会将酶和底物稀释，从而降低酶促反应速率，所以操作室内的相对湿度要适当。综合考虑，空气相对湿度在80%为宜。
3.2 钝化温度对相对脂肪酶活力的影响
结果显示，随着温度的升高，相对脂肪酶活力呈先降低后增加趋势，当温度达到70 ℃时，相对酶活力达到最低。而温度继续升高后，相对酶活力出现上升趋势，木瓜蛋白酶的有效作用温度范围是20～80 ℃，超过80 ℃时，木瓜蛋白酶活性会下降，温度升高到90 ℃时木瓜蛋白酶会钝化。因此，固定化木瓜蛋白酶膜作用的最佳温度在70 ℃左右。
3.3 钝化时间对相对脂肪酶活力的影响
结果显示，随着钝化时间的延长，米糠的相对脂肪酶活力先急剧降低，在超过100 min后酶活力降低的速度减缓，在第120分钟时达到最低，因此综合考虑钝化时间以100 min为宜。
响应面法优化钝化工艺
4.1 响应面试验设计与结果
综合单因素试验的结果，以空气相对湿度（A）、钝化温度（B）、钝化时间（C）3 个因素进行优化，以相对脂肪酶活力（Y）为响应值，进行3因素3水平的响应面分析，使用Design-Expert8.0.6设计响应面试验以优化参数。
4.2 响应面模型方程建立与显着性分析
利用Design-Expert软件进行拟合得到的空气相对湿度（A）、钝化温度（B）和钝化时间（C）与相对脂肪酶活力（Y）之间的二次多项回归方程如下：
Y＝31.46－3.33A＋0.51B－4.09C＋0.80AB＋2.15AC－1.22BC＋4.43A2＋8.36B2＋4.36C2
利用Design Expert8.0.6软件对实验结果进行方差分析。结果显示，整体模型的F＝174.65，P＜0.000 1，模型极显着，表明回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，因变量与所有自变量之间的线性关系显着，即这种实验方法是可靠的。失拟项是用来表示模型与试验拟合的程度，即二者差异的程度。失拟项F值为1.09，P值为0.450 9，失拟项不显着，表明该模型选择正确，且模型中的调整系数R2Adj为98.99%，说明98.99%的响应值变化可通过拟合模型进行解释，相关系数R2为99.56%，表明模型与实验拟合良好，可以用此模型来分析和预测相对脂肪酶活力。从回归方程系数的显着性检验可看出：一次项A和C对响应值的影响极显着，B对响应值的影响不显着。
4.3 响应面交互作用分析
本研究考察空气相对湿度、钝化温度和钝化时间3 个因素对米糠的相对脂肪酶活力的影响，钝化参数交互作用对相对脂肪酶活力的影响如图5所示。可以看出，空气相对湿度、钝化时间、钝化温度3 个变量在两两交互时，保持其中1 个变量不变，随着另外2 个变量的增加，相对脂肪酶活力呈现先降低的趋势，当达到一定值时又呈现出上升趋势。3 个因素中AC和BC交互作用为极显着，AB是不显着，即空气相对湿度和钝化时间之间以及钝化温度和钝化时间之间有极显着交互作用，空气相对湿度和钝化温度之间的交互作用不显着。
通过试验设计优化得到酶膜稳定米糠的最佳工艺参数为空气相对湿度72.2%、钝化温度70.5 ℃、钝化时间113.4 min，该条件下米糠的相对脂肪酶活力预测值为34.8%。根据实际情况将工艺参数进行整理，得出整理值为空气相对湿度72%、钝化温度71 ℃、钝化时间113 min。在此条件下进行3 次平行实验，该条件下相对脂肪酶活力平均值为35.2%。实测值与预测值之间具有良好的拟合性，从而证实了模型的有效性。同时，测定了在此最佳工艺参数下固定化酶膜钝化后米糠的过氧化物酶活力，以新鲜米糠的过氧化物酶活力记为100%，测定结果为过氧化物酶的相对酶活力降到了23.3%，结果表明此方法可以有效钝化米糠中的关键酶，从而提高米糠的贮存稳定性。
固定化酶膜的操作稳定性
在响应面优化的最佳条件下（空气相对湿度72%、钝化温度71 ℃、钝化时间113 min）处理米糠后，重复使用次数对固定化酶膜相对酶活力的影响如图6所示。由图6可看出，酶膜的相对酶活力随重复使用次数的增加而降低，经10 次使用后，相对酶活力为54.2%。但酶膜在重复使用6 次后，相对酶活力仍可保持在73.0%以上，说明此酶膜具有良好的操作稳定性。
复合酶膜钝化后米糠的贮存稳定性
结果显示，在2 个月的贮存期间里，经固定化木瓜蛋白酶膜钝化后的米糠，其相对脂肪酶活力仍低于36.0%，几乎无明显变化。应用固定化木瓜蛋白酶膜稳定米糠是一种能有效提高米糠贮存稳定性的方法。
结 论
本实验针对米糠的不稳定性质导致其利用率低的缺点，应用CA-PTFE复合膜固定化木瓜蛋白酶对米糠进行钝化处理，降低了米糠中脂肪酶的活力并以此为指标，通过响应面法优化了空气相对湿度、钝化温度和钝化时间对钝化效果的影响，确定了固定化酶膜钝化米糠脂肪酶的最佳钝化条件，在最佳条件下处理后的米糠相对脂肪酶活力为35.2%，表明米糠中的脂肪酶得到有效钝化。且稳定后的米糠贮存2 个月后，其相对脂肪酶活力仍低于36.0%，同时固定化木瓜蛋白酶酶膜重复使用6 次后的相对酶活力仍保持在73.0%以上。本实验在提高米糠稳定性同时，解决了传统游离蛋白酶钝化米糠不可重复利用的问题，降低了生产成本，为酶法稳定米糠提供了新工艺与理论依据。
