上接：食品理化检验方法主要内容和使用要点解读（上）
本期食品理化检验方法主要内容和使用要点解读延续上期内容，重点阐释技术内容中的分析步骤。
分析步骤：
1）试样制备：试样制备作为分析步骤的前端，要求关联抽样、制样、检验、复检等具体实施情况，涉及抽样数量（包含检验数量、复检备样数量）、包装个数、样品预处理（冷冻、加入抗氧化剂、加热熔融、含维生素类样品避光等）、样品制备部位、制备后样品数量、制备后样品存储条件、制样均匀性等。实验室制样规程要充分消化吸收各检测方法对试样制备的要求，考虑判定依据、试样称取量、产品标准、化合物稳定性等因素。复检机构也要和初检机构交流试样制备的注意事项。
如，GB 5009.22-2016食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定液体样品，如液体样品（植物油、酱油、醋等）采样量大于1L，对袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装（同一批次或号），将所有液体样品用匀浆机混匀后，对其中任意的100g（mL）样品进行检测。
2）试样溶液的制备：整个食品安全性的检测分析中，较大部分时间用在样品的前处理上，而实验误差也主要来自样品前处理。
试样提取：方法中一般会明确取样量（注意精度要求），取样量影响到抽样数量和复检备样数量。方法中还包括前处理方式和稀释倍数等，要充分理解测试对象的针对性，如目标化合物的极性、形态、旋光、结合型或游离型、内源型或外源型、稳定性等。一般会有直接提溶剂提取（如超声萃取、微波萃取、加速溶剂提取等），也有酸水解、酶解、碱化处理、皂化、沉淀蛋白、蒸馏、索氏提取等。提取过程中可能会加入抗氧化剂，或进行避光操作等；也可能是酸硝化消解，如元素的测定。不同基质可能会采取不同的前处理方式，如GB 5009.120-2016食品中丙酸钠、丙酸钙的测定，蒸馏法适用于豆类制品、生湿面制品、醋、酱油等样品，直接浸提法适用于面包、糕点。为保证提取的充分性，尤其内源性结合的化合物，要考虑样品的基质分散性、固体样品的渗透性（如茶叶加水浸泡、乳粉加水复溶等）、皂化完全、水解酶解充足、消解充分等，要注意酶活、时间、酸碱、皂化试剂量、提取溶剂量、提取功率、提取时间、提取次数等。
试样净化：净化方式一般有液-液萃取、固相萃取（反相萃取或正相萃取）、固相微萃取、基质分散、凝胶渗透、离子交换、免疫亲和、分子印迹、酸碱转化、QUECHERS处理、混合模式净化、顶空分离等，部分农药残留项目还采取磺化处理。净化时需注意净化原理，才能清楚每一步操作要点。一是注意净化前对耗材的性能评价，还需考察耗材对空白是否存在干扰，方法验证时可针对多品牌的耗材进行比较筛选。二是使用前的活化平衡，严格按照方法描述或产品说明书进行，注意平衡时间和活化溶剂用量。三是上样，如提取液有浑浊现象，如使用水溶液（缓冲盐溶液、酸碱溶液等），提取溶液体积大、杂质多，可采用低温高速离心、快速滤纸过滤或玻璃纤维过滤等；上样量需和净化耗材规格（载量）匹配，还要注意上样介质，尤其极性、pH、上样流速等，离子交换尤其对流速敏感。四是洗脱过程，按照方法选用合适的洗脱溶液，必要时可分步洗脱，洗脱流速对方法回收率也很关键；如回收率不稳定或结果重现不好，可核查是否需要加大洗脱体积。特别注意的是，在进行极性差异较大的两相交换时要注意抽干。如GB/T 21981-2008动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法中，净化（7.2）在上样后，由甲醇-水介质转换为二氯甲烷-甲醇介质洗脱，极性差异较大，需尽力抽干，才能充分洗脱目标物质。洗脱中还需要注意洗脱液的酸碱度，一定要正确收集目标洗脱液。
另外，在有些情况下，提取后的试样溶液还需要进行衍生处理，其中衍生试剂用量、衍生介质pH、衍生温度时间、衍生后溶液放置的稳定性等都对结果有一定影响。部分项目衍生后还要进一步液液萃取净化。如GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法，提取和净化（7.2）操作中pH调节是关键，pH在7-7.5之间时，四种代谢物衍生物萃取效率最高。
试样溶液的制备：试样在经过提取、净化后，往往还要采取氮吹、旋蒸等浓缩处理，对一些较为不稳定的目标化合物，需注意温度、流速、浓缩程度等。按照方法要求进行复溶，为避免溶剂效应，一般会采取初始流动相比例的溶液进行复溶。方法中还可能使用空白基质溶液复溶来减少基质效应。有些兽药残留项目复溶后，如溶液仍显浑浊，可采取低温冷藏后进行离心或在对目标化合物没影响的情况下使用少量正己烷进一步脱脂。复溶过滤时需注意滤膜可能吸附或干扰的情况。
而元素项目，试样溶液制备中重点关注的是试样溶液的酸度和标准系列溶液酸度的一致性，在含量较低情况下，可能容器会对元素进行吸附而影响检验结果，需及时开展检测。有些项目需要进行显色剂比色后测定，要注意显色试剂、用量、加入顺序、显色温度、时间及放置稳定性等条件的控制。
3）空白试验：全空白试验监控从试样制备到试样溶液的制备整个环节，对分析接触工具（菜板、粉碎机等）、人员（制样人员、检验人员等）、试剂、接触耗材（酶、固相萃取小柱、滤膜、色谱柱等）、试验器皿、仪器分析系统等对样品的交叉污染或干扰至关重要。试样制备必须注意防范污染，而试样溶液的制备务必同步制备全空白溶液。
□余晓琴
四川省食品药品检验检测院
