冻干质控菌种的使用、培养保存

1 复苏菌种前应准备适于该菌种生长的固体、液体培养基和培养设备，所有操作均应在符合生物安全保护及无菌条件下进行。

2 启开菌种前，用75%酒精棉消毒西林瓶表面。在无菌条件下，按铝盖上的箭头方向打开塑盖，撕开铝盖，打开西林瓶胶塞，加入0.3mL左右的配套液体培养基，用无菌滴管反复吹吸，将冻干菌种溶解成为悬液，然后用无菌滴管或接种环移至斜面、平板或液体培养基，并连同剩余菌悬液的西林瓶一起放置于36℃培养箱中进行培养。（菌种与培养和保存方法对应表见附表1，培养基、培养方法和传代保存方法见附表2）。

3 次日观察菌种的生长情况，如未生长，应继续培养24h，或吸取培养之后的菌悬液中再次接种培养基，培养24h观察。

4 菌株为一次性使用品，开启之后不能反复使用或保存，暂不开启的菌种应在4℃保藏。

5 复苏后的菌种在传1-2代后使用，建议菌种使用5代后弃用。

 注）：购买后请尽量及时使用冻干菌种，如发现菌种不活或污染等情况，请在购买之日起1个月内与我们联系。

冻干菌种复苏示意图：

附表1  菌种与培养和保存方法对应表

附表2  培养基、培养条件和保存方法

方法1：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于营养琼脂（022020）斜面上35－37℃划线培养24－48h。斜面（第一代）放于4℃冰箱保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法2：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于营养琼脂（022020）斜面上划线35－37℃培养24－48h。斜面（第一代）放于25℃下保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法3：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于血平板（024070）后涂布，35－37℃培养24－48h。平板（第一代）放于4℃冰箱保存，并用封口膜或其它封条密封平板，每半个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法4：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）（026020）斜面上35－37℃培养24－48h。斜面（第一代）放于4℃冰箱保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法5：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于疱肉牛肉粒肉汤（027140）加液体石蜡1cm,35－37℃培养48－72h。肉汤（第一代）放于4℃冰箱环境下保存，每半个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法6：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入碱性蛋白胨水，充分悬浮后取适量的菌悬液于碱性琼脂（025040）斜面上35－37℃培养24－48h。斜面（第一代）放于25℃下保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法7：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入3％NaCl碱性蛋白胨水，充分悬浮后放置于36℃下复苏8-12小时。取适量的菌悬液于3％NaCl营养琼脂（营养琼脂（022020）加入2.5gNaCl/100mL）斜面上35－37℃培养24－48h。斜面（第一代）放于25℃下保存，每个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法8：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入沙氏液体培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA）（021050）斜面25－28℃培养2－5天。斜面（第一代）放于4℃冰箱保存，每两个月转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法9：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入布氏肉汤，充分悬浮后取适量的菌悬液于血平板（024070）42±1℃微需氧条件下培养48－72h。平板（第一代）放于4℃冰箱微需氧环境下保存，并用封口膜或其它封条密封平板，每个星期转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法10：

无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干菌粉中加入TPY肉汤，充分悬浮后取适量的菌悬液于BBL琼脂（027330）斜面厌氧环境下35－37℃培养48h－72h。斜面（第一代）放于4℃冰箱厌氧环境下保存，每个星期转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应销毁。

方法11：

       无菌条件下，用无菌吸管往西林瓶冻干粉中加入脱脂奶粉溶液，充分悬浮后取适量的菌悬液于脱脂奶粉溶液（10%）35－37℃培养48h-72h。 菌种（第一代）放于4℃冰箱保存，每两个星期转接一次，代数以此类推，建议使用菌种代数不超过5代，5代后菌种应消毁。