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细胞培养基的选择及常用技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2017-04-13
核心提示:经典的培养基有很多种,Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。
  经典的培养基有很多种,Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。
 
  MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的,其中增加了组分的范围及浓度。
 
  Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的,现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍,维生素浓度是MEM的4倍,采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L,后来为了某些细胞的生长需要,将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L,这就是大家常说的低糖和高糖了。
 
  aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸,它可广泛应用于各种细胞类型,包括对营养成分要求苛刻的细胞。
 
  Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的,现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用,得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物,这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。
 
  RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的,现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。
 
  以前经常听到有人问,这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单,也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库,那很简单,问供应商就行了。或者找到相关的文献,作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具,也很好用。选择你感兴趣的细胞类型,它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等,有时还有优化好的转染步骤,很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert,包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等,它还是一个解决问题能手,对于细胞培养中的常见问题,如细胞贴壁不好、培养基变色等,它都会列出可能的原因,并提供补救办法。
 
  但如果你是着手建立一种全新细胞的培养体系,根本找不到任何参考,那你就得花点时间自己试验了。万事开头难嘛。因为没有一个标准答案。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做贴壁细胞培养、RPMI 1640做悬浮细胞培养会是一个好的开始。你也可以购买几种培养基来,然后花大约两周的时间做一个简单的细胞生长实验,来选择其中最适合的。有时候你会惊讶地发现你的最佳培养条件与文献报道的不同,就算是同一种培养条件,细胞的生长状态也时好时坏,这是很正常的。因为试剂、水、不同批号的血清之间都存在着差异。要提高培养基的稳定性,可以从培养基和血清两方面入手。
 
  是一个解决问题能手,对于细胞培养中的常见问题,如细胞贴壁不好、培养基变色等,它都会列出可能的原因,并提供补救办法。这个Expert果然不简单!
 
  但如果你是着手建立一种全新细胞的培养体系,根本找不到任何参考,那你就得花点时间自己试验了。万事开头难嘛。因为没有一个标准答案。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做贴壁细胞培养、RPMI 1640做悬浮细胞培养会是一个好的开始。你也可以购买几种培养基来,然后花大约两周的时间做一个简单的细胞生长实验,来选择其中最适合的。有时候你会惊讶地发现你的最佳培养条件与文献报道的不同,就算是同一种培养条件,细胞的生长状态也时好时坏,这是很正常的。因为试剂、水、不同批号的血清之间都存在着差异。要提高培养基的稳定性,可以从培养基和血清两方面入手。
 
  以前大部分实验室都是用干粉培养基,但配制过程就较为繁琐,要溶解、调pH值,过滤,过程中可能会产生一些浓度误差,而且有些实验室的水质并不理想,所以培养的效果会有差异。如果使用液体培养基,这种人为的误差会减少,因为毕竟是大批量工业化生产的,批间差会很小。大家是不是感觉液体培养基会贵很多,以前是这样,但现在非也。HyClone和Invitrogen都在国内建立了液体培养基的生产基地,生产和运输成本大幅降低,所以现在的价格也只是50-60元/500ml,比干粉培养基贵不了多少,而且还帮你省了过滤器和时间。
 
  血清含有生长因子可促进细胞的繁殖,含有附着因子可促进细胞的贴壁,同时还具有抗胰酶活性。血清同时也是矿物质、脂类及激素的来源。最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和马血清等。牛血清是按照采血时间的早晚来分类的。采血时间越早,营养物质越丰富,所含抗体也越少,因而胎牛血清适合要求高的细胞系和克隆化培养。由于疯牛病的原因,到目前为止,我国政府仍然禁止从北美洲、欧洲和日本等地区进口牛血清,因此市面上的牛血清大多来自澳洲、南美洲,或是国产的。
 
  而血清批次间的差别就是不可避免的,这种差异来源于不同的制备方法和除菌方法、动物的年龄差别及血清的储存条件等,而且与取血动物的来源关系密切。不同的牧场、不同的气候天气及其他环境因素都可能影响血清的质量。因此选好了一种血清就要尽可能长期使用它。在需要更换时,也要尽量保持与原有的一批血清相似。现在很多公司都提供血清预留,你一旦选定了某个批次的血清,最好备足一年的量,这样可以避免很多麻烦。
 
  血清固然是细胞培养中不可或缺的成分,但正如上文所说,血清的批间差异大,更换血清时需要做大量的测试以取保替换的血清与原来的相似。而血清的供应也是必须要考虑的因素。由于气候或疯牛病的影响,说不定哪天血清就突然没得卖了,那对实验的影响可非同小可。另外,血清的价格也很昂贵,虽说现在也有便宜的国产血清,但是高品质的澳洲血清价格仍旧高企。因此,也有一些实验室开始换用无血清培养基。
 
  无血清培养基(Serum-Free Media),通常以SFM表示,顾名思义,就是在细胞培养中不需要添加血清,但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分:粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等,能减少上述血清带来的不利因素,使细胞培养的条件更稳定。但它也不是完美的,从有血清培养过渡到无血清培养的条件并不像想象中那么直截了当。处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方,对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。而且在去除血清的同时,也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用,因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。另外,它的价格也比普通的培养基贵很多。
 
  现在有很多厂家生产无血清培养基。GIBCO这个细胞培养的金字招牌当然少不了,它也是最早研制无血清培养基的。目前已经开发了ES细胞、杂交瘤、CHO、293、昆虫细胞、神经细胞、淋巴细胞、角质细胞、内皮细胞等多种细胞的无血清培养基。上个月还推出了首个间充质干细胞的无血清培养基,能使MSC维持未分化状态超过9代。HyClone公司也有CHO、293、杂交瘤细胞、昆虫细胞、病毒疫苗细胞的多种无血清培养基。Sigma则刚刚收购了澳大利亚JRH公司,有了JRH的EX-CELL系列,无血清培养基的选择也更多了。
 
  这么多种,要选择起来也是个头疼的事情。除了部分培养基是公开配方的,如用于培养内皮细胞的MCDB 131(Sigma),大部分液体培养基都是专利配方的,也就是说其中的成分是保密的。那么你只能是检索文献、让供应商推荐,然后用自己的细胞做几次传代培养来选出最合适的培养基。
 
 
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