自1982年美国首次报告了由大肠杆菌O157:H7引起的出血性肠炎，随后在全球范围内出现了多起大肠杆菌O157:H7食物中毒事件，仅在日本，曾发生过9 000多位儿童集体感染的事件，1996—2004年间，每年用于大肠杆菌O157:H7感染的费用为4.05亿美元。2011—2013年，甘肃省共报告食源性病原菌爆发时间约为81 起，发病1 089 起，死亡17 例，病死率为1.56%。因此，致病菌的检测在食品安全检测方面尤为重要。随着食品工业技术的发展，建立一种快速、准确、灵敏度高、特异性强的方法来检测食品中的致病菌是当今社会最需要的检测技术。
传统的PCR检测手段无法同时检测食品样品中携带的多种病原菌。多重PCR作为一种可同时检测多种病原菌的快速且可靠的手段，已在疾病预防控制中心及第三方检测平台得到广泛应用。来自大连理工大学生命科学与技术学院和大连民族大学生命科学学院的冯可、胡文忠、姜爱丽等人利用多重PCR检测技术成功建立了可同时检测单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的方法，且适用于鲜切哈密瓜受这3 种目标菌污染后同时检测。
讨 论
在多重PCR检测技术中，靶基因的选择直接决定着检测方法的准确性和可靠性。单增李斯特菌的内化素岛上含有一个多基因家族（inlA、inlB、inlC、inlC2D、inlD、inlE、inlF、inlG和inlH），其中InlA和InlB分别与钙黏蛋白和补体分子CIq受体结合，从而介导单增李斯特菌进入上皮细胞、肝细胞、成纤维细胞等。鼠伤寒沙门氏菌携带的具有较强特异性的靶基因分别为pefA、sefA和invA。大肠杆菌O157:H7的O抗原抗体由wzy基因编码。wzy基因可以作为O157的特异性标志基因，检测食品中的大肠杆菌O157。因此，该技术选择单增李斯特菌的inlA基因、沙门氏菌的invA基因及大肠杆菌O157:H7的wzy基因作为检测的靶基因。
影响多重PCR有效扩增的因素较多，引物浓度配比、Mg2＋浓度、dNTPs浓度及其比例等因素的控制不当，都将导致产生非特异性产物甚至扩增失败。对多重PCR反应条件的优化有利于得到更明确、清晰且均匀的目标条带。研究表明，经优化后得到的单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的引物浓度均为0.2 μmol/L，大肠杆菌O157:H7的引物浓度为0.4 μmol/L。
结 论
针对单增李斯特菌inlA基因、鼠伤寒沙门氏菌invA基因、大肠杆菌O157:H7wzy基因设计及筛选出3 对引物，引物特异性强，互不干扰。
建立了一种能够同时检测单增李斯特氏菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌3 种致病菌的多重PCR检测方法。其反应体系为：25 μL反应体系：10×PCR buffer为2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）为3.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）为2 μL，inlA上下游引物（5 μmol/L）为1 μL，invA上下游引物（5 μmol/L）为1 μL，wzy上下游引物（5 μmol/L）为2 μL，单增李斯特菌DNA模板为1 μL，鼠伤寒沙门氏菌DNA模板为1 μL，大肠杆菌O157:H7 DNA模板为1 μL，exTaq DNA 聚合酶（5U/L）为0.3 μL，加ddH2O补足25 μL。多重PCR反应程序为：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，53.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 个循环；72℃延伸10 min。
多重PCR对单增李斯特菌，大肠杆菌O157:H7及鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度分别为1.3×103、2.3×103 CFU/mL和1.8×104 CFU/mL。而对鲜切哈密瓜中人工接种的目标菌的灵敏度分别为单增李斯特菌2.7×104 CFU/g，大肠杆菌O157:H73.3×104 CFU/g以及鼠伤寒沙门氏菌3.8×104 CFU/g。
本研究建立的检测鲜切哈密瓜中易受侵染的3 种病原菌的多重PCR检测方法具有很高的特异性和灵敏度，该方法的建立相较于传统的培养检测方法可节约大量的劳力、试剂、时间等，对于企业或分析检验中心大批量样品的监测具有指导意义。
