传统的培养方法的优点为检测对象都为活菌(因为死菌不可培养),但是它的缺点是耗时较长以及容易造成假阴性,这是由于大部分环境中的微生物处于“VBNC”(viable but nonculturable)状态,这种状态的细菌不能进行培养,却仍旧保存活力,经过一定条件的复苏可以重新恢复活力,采用培养法检测,会造成漏检。
而不经培养直接进行分子检测是对微生物的DNA进行检测,因其高灵敏度和快捷等优点,广受各实验室青睐。但是在实际检测过程中,该方法容易造成假阳性,如死菌的DNA还未彻底降解,而这类DNA容易被分子方法检测到。
为了更好的发挥分子检测的优势,我所研究人员开发了一套独特的检测方法(TK II),用来克服死菌造成的假阳性问题。我们构建了四组分子检测实验:
1.死菌(浓度从107~101),采用普通分子检测流程(TK I);
2.活菌(浓度从107~101),采用普通分子检测流程(TK I)。
3.死菌(浓度从107~101),采用我们特殊的分子检测流程(TK II);
4.活菌(浓度从107~101),采用我们特殊的分子检测流程(TK II)。
实验结果见下图,当死菌的浓度在106~103 CFU/mL之间时,利用TK II 检测方法,均为阴性,而用该方法对活菌进行检测时,检测结果不受影响,即和TK I 检测结果一致。
这套体系的建立,显着的克服了分子检测容易造成假阳性的缺点,为我所的分子检测的发展也奠定了一个良好的基础。
( TK I 与TK II 检测结果 )
M:100bp DNA ladder;
1~4:菌液浓度为107 CFU/mL;
5~8:106 CFU/mL;
9~12:105 CFU/mL;
13~16:104 CFU/mL;
17~20:103 CFU/mL;
21~24:102 CFU/mL;
25~28;101 CFU/mL;
29:NTC
1、5、9、13、17、21、25:TK I;
2、6、10、14、18、22、26:TK I;
3、7、11、15、19、23、27:TK II;
4、8、12、16、20、24、28:TK II。