一、细菌“种”的概念是什么？
在进行细菌新种鉴定前，我们首先要明确一个概念——种。细菌的种是一个基本分类单位，它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。在微生物尤其在原核生物中，种的定义极其难定，至今还找不到一个公认的、明确的种的定义。对于细菌，早前的判定标准是16S rRNA 基因序列相似性≥97%，之后这个值在97%~99%之间波动。
2014年的一份基于基因组的拟合的研究提出这个阈值应该为98.65%（Kim, et al. 2014，IJSEM）。在细菌新种鉴定时，我们也需要根据这些阈值进行疑似新种的筛选（见下文查找疑似新种部分内容）。
二、什么是多相分类学？
多相分类学（Polyphasic Taxonomy）这一概念是由Colwell 于1970 年首次提出的，即综合不同的分类学方法对菌种及基因组信息分析等。细菌多相分类学是细菌分类学的一大发展，它将微生物研究的不同方法及信息整合在一起，用于细菌各级类群的划分，可以对各个分类单元上的类群进行鉴定和研究，对细菌的分类具有里程碑意义。
原则上，多相分类研究应该包括基因型、表型和系统发育信息，基因型信息来源于细胞中的DNA 或者RNA，表型信息来源于各种蛋白及其功能、不同的化学分子标记以及其他方面的特征。用于分类学研究的分子很多，比如16S rRNA 基因、脂肪酸、呼吸醌等。现如今，16S rRNA 基因序列分析、DNA 杂交、G+C 含量测定等方法已经成为经典方法，几乎所有的多相分类学研究都会用到。传统的表型分析方法与这些方法相比，显得费时费力，但是也是保证多相分类学研究结果更加全面的基础。
三、多相分类学方法进行细菌新种鉴定。
利用多相分类学的方法进行细菌新种鉴定，基本方法可归结成下图所示：
1. 16S rDNA 基因相似性比对，查找疑似新种
首先我们明确16S rDNA基因序列相似性对于新种的界定，那我们该如何确定哪些菌株是我们所要关注的疑似新种呢？这里，我们可以采用上述对于种的判定阈值98.65%，即，16S rRNA 基因序列相似性<98.65%的菌株，做为我们的重点研究对象（即疑似新种）。
2. 构建进化树，确定标准菌株
在确定好研究对象后，将16S rDNA 基因全长序列与经过严格筛选的模式菌株序列数据库中的模式菌株序列进行比对，初步确定疑似菌株的分类学地位。根据这一结果，从GenBank 中选取其最相近的模式菌株的16S rDNA 序列，构建系统发育树。根据系统发育关系及序列相似度，来确定多相分类学研究的标准菌株。
3.菌落菌体形态特征观察
菌落形态：划线培养，观察菌落形态、大小、边缘是否整齐、菌落是否湿润等。
菌体形态：可先进行革兰氏染色，在低倍显微镜下初步观察其染色情况、菌体形态等特征。再进行透射电镜观察其细胞形态、大小、有无鞭毛等。
4.生长条件测定
生长条件包括：温度范围、耐受的盐度范围、pH生长范围等。这些在液体培养基上进行梯度试验即可。另外厌氧生长也是其生长条件试验的重要一项。
5.底物利用及产酸试验
测定对各种底物的利用情况及相应的产酸情况，如：各种糖、醇类物质，纤维素、琼脂、淀粉等。主要判定标准是：添加某种底物，菌体是否生长，同时培养过程中，培养基颜色发生的变化。
6.酶学及抗生素敏感性检测
测定菌体是否能够产生某种酶，如：氧化酶、触媒、DNA酶、淀粉酶、明胶酶等。主要判定标准是：添加底物的固体培养基上是否产生透明圈（氧化酶除外）。
7.API试剂条验证
API试剂条有很多种，常用的有：API20NE、API20E、APIZYM、API50CH等。API20NE可以测定微生物利用的碳源；API20E可以测定微生物发酵/氧化的各种糖类物质；APIZYM可以测定各种酶学特征。一般较常使用的就是这三种，根据试剂条上附带的说明使用即可。
（现在市场上出现了细菌的数值分类和自动化，其原理同样是利用细菌的生理生化特征而设计，目前应用较多的自动化鉴定系统主要有：Vitek-AutomatedMicrobicSystem （AMS ）、Biolog 、MicroScan 、Entero-tube 、MIDI 、Sensititte、Autosceptor、Crystal 等，如果有条件的实验室，同样可以采用这些仪器进行生理生化特征鉴定。）
8.极性脂
细菌的细胞内含有各种类型的脂质，极性脂是细菌细胞膜脂双分子层的主要组成部分，在属级分类单元上具有较好的分辨力。主要包括：磷脂、糖酯、氨基脂等。可用双层TLC板展层，不同显色剂显色分析。
9.脂肪酸组分分析
脂肪酸是脂质和脂多糖的主要成分，同极性脂一样已被用作分类鉴定的化学特征。脂肪酸的链长，双键的位置，基团差异都已经被用于表征细菌类群。脂肪酸在不同菌株中有明显不同，往往可以作为属或者种的特征指标。可用标准的MIDI protocol进行测定。
10.呼吸醌
呼吸醌包括甲基奈醌和泛醌，位于大多数原核生物的原生质膜上，在电子传递，氧化磷酸化和主动运输中起重要作用，侧链长度和氢饱和度的变化是分类学上的指标之一。在属级分类单元上具有较好的分辨力。可用HPLC法检测。
11.基因组DNA-DNA杂交
DNA-DNA 杂交技术又叫DNA-DNA 同源性分析，根据碱基互补配对的原理，对两条来源不同的DNA 进行高温变性，解链再复性，以复性后的杂交百分比来计算同源率的方法。DNA-DNA 杂交值或相对结合率是间接比较两个完整基因组序列相似性的参数。一般选择的阈值为70%，即小于70%即可判读为一个新种。
12.基因组DNA G+Cmol%测定
G+C mol%含量，即DNA 碱基的组成。不受菌龄和外界因素影响且其具有种特异性，因此成为菌分类研究中的标准描述之一。一般认为，种内G+C mol%含量相差范围不超过3%，属内G+C mol%含量相差范围不超过10%。测定方法可选用HPLC法或者通过测序的基因组数据计算。
四、新种的保藏和命名
鉴定后的菌种与标准菌株进行对比，确定为新种的话，要送往两个以上保藏机构保藏，并获得保藏编号和保藏证书。
菌株的命名规则可参考《国际细菌命名法规》（International Code of Nomenclature of Bacteria, 简称Bacteriological Code）。
