超低温保存造成的细胞死亡主要有以下三种类型: 细胞破裂(与冰晶生成有关)、细胞坏死和细胞凋亡。部分研究发现, 超低温保存造成的细胞死亡具有迟发性, 进一步研究迟发性死亡的背后机制显示, 这种死亡主要是由细胞坏死和细胞凋亡这两种途径所造成的。其中, 区别于细胞坏死的被动过程, 细胞凋亡作为一种与能量相关的, 由基因控制的细胞自主、有序的死亡方式, 得到了超低温保存机制研究者的广泛关注。
细胞凋亡通常会采用半胱氨酸蛋白酶活力、磷脂酰丝氨酸的外化、线粒体膜电位的改变和DNA片段化等参数进行检测。Paasch等比较了超低温保存对人类精子细胞凋亡参数的影响, 发现超低温保存后, 半胱氨酸蛋白酶-3、-8和-9的活性显着上升, 线粒体膜电位下降, 但DNA片段不存在显着变化。Martin等同样在超低温保存后的牛精子中发现线粒体膜电位的降低、半胱氨酸蛋白酶活性和细胞膜通透性升高等现象, 并检测到了细胞色素C和凋亡诱导因子这两种伴随细胞凋亡的蛋白的产生, 但没有发现DNA片段化和细胞核浓缩的显着变化。
Vogel通过免疫印迹技术比较了人类真皮的成纤维细胞中线粒体蛋白质Bcl-XL和Bax的比值(这两种蛋白的比值代表了细胞凋亡正向和负向的比例), 发现在超低温保存复温后比值略有升高, 在之后的6 h和12 h显着上升, 直到24 h才恢复到与对照相当的水平。Liu等在比较超低温保存前后的小鼠卵巢卵泡的基因组时, 发现超低温保存诱导了凋亡基因Fas和Fas配体的表达。Park等同样证明了冻融过程引起了牛囊胚细胞中与凋亡相关的生存素、Fas、热休克蛋白70和半胱氨酸蛋白酶-3基因表达量的增加。
以上研究在证明超低温保存与细胞凋亡的相关性之外, 也为如何减轻或消除细胞凋亡的影响指明了道路。半胱氨酸蛋白酶抑制剂已被证明在猪肝细胞超低温保存中降低了半胱氨酸蛋白酶-3的活性、减少线粒体中细胞色素C的释放, 减慢线粒体膜电位的下降速度, 并使肝细胞活力的功能指标 —白蛋白产量、 地西泮的代谢和尿素产量显着增加。而在大鼠的肝细胞超低温保存中, 添加半胱氨酸蛋白酶抑制剂则显着改善了复温后6 h和24 h的肝细胞的分化能力和功能 。
氧化应激和细胞凋亡作为近年来超低温保存中生理现象的两大研究热点, 其本身也存在着千丝万缕的联系。研究表明, 超低温保存中出现的氧化应激不仅可以直接造成细胞损伤, 也可能诱导了细胞凋亡, 如活性氧活化核转录因子NF-κB(nuclearfactor-kappa B, NF-κB), 导致细胞凋亡; 或通过作用于线粒体介导细胞凋亡; 活性氧导致DNA损伤, 激活p53, 诱导细胞凋亡以及ROS激活SAPK通路介导细胞凋亡等。图2所示线粒体产生的活性氧介导的细胞凋亡,可以在一定程度上反映超低温保存中细胞凋亡与氧化应激的关系。
