壹
ISO 22964的前生今世
2006年2月，国际标准化组织发布了ISO/TS 22964：2006 Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii（乳和乳制品-阪崎肠杆菌检验），该文件属于ISO的技术规范（Technical Specification，TS），是在ISO的技术委员会内部达成一致的文件。当ISO的技术委员会决定制定一项国际标准的支持票不够多时，可启动程序批准其作为技术规范出版。
ISO一般每三年对TS复审一次，以确定其在接下来的三年内是否继续有效，或修订成国际标准，或予以作废。
2015年5月，国际标准化组织发布了ISO/ DIS 22964：2015 Microbiology of the food chain—Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.（食品链微生物学-克罗诺杆菌属基准检验方法），该文件属于ISO的国际标准草案（Draft International Standard，DIS），是对技术规范ISO/TS 22964：2006的修订。
该草案的检测目标从阪崎肠杆菌扩大至克罗诺杆菌属，检测范围从乳和乳制品扩展至食品、动物饲料以及食品生产加工环境的样品，标准名称也作了相应的修改。
2017年2月，国际标准化组织发布了ISO/ FDIS 22964：2015，该文件属于ISO的最终国际标准版草案( Final Draft International Standard，FDIS )，ISO/ FDIS一般只需进行最后的修改和投票，即可作为正式发行的国际标准版( International Standard，IS )发布。
2017年5月，国际标准化组织正式发布了ISO 22964：2017 。
贰
ISO 22964：2017的主要变化
通过比较发现，ISO 22964：2017与ISO/TS 22964：2006存在较大的技术差异，其主要变化如下：
1、前增菌
ISO常用的前增菌温度为37℃±1℃，新发布的ISO 22964：2017还采纳了一些国家标准中常用的前增菌温度：35℃±1℃，其前增菌的温度范围也相应扩大至34℃～38℃。我国常用的克罗诺杆菌属前增菌温度为36℃±1℃，该温度也在这一范围内。
必须指出的是，虽然前增菌温度范围已扩大至34℃～38℃，但不宜想当然地把培养箱的温度设置为36℃±2℃。
2、选择性增菌
ISO 22964：2017 用克罗诺杆菌增菌肉汤(Cronobacter selective broth，CSB)代替改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium，mLST)作为选择性增菌液，选择性增菌的温度也从44℃±0.5℃改为41.5℃±1℃. 有研究数据表明，新的选择性增菌方法更有利于克罗诺杆菌复苏和生长，检测得到的阳性率更高。
另外，CSB的配方中采用了溴甲酚紫作为糖发酵的指示剂，其颜色变化比mLST的浊度变化，更有助于阳性结果的判断。而且检测工作效率更高，当选择性培养24 h后，CSB的颜色仍为紫色，即可初步推断为克罗诺杆菌检测结果为阴性。
3、选择性分离
ISO 22964：2017 用克罗诺杆菌显色分离(Chromogenic Cronobacter isolation，CCI)琼脂代替了阪崎肠杆菌分离琼脂(Enterobacter sakazakii isolation agar，ESIA)，选择性分离的温度也由44℃±0.5℃改为41.5℃±1℃. 这是因为有少量的克罗诺杆菌对结晶紫、44℃的温度敏感，不能在ESIA上生长。
另外，CCI还将显色剂的浓度提升至0.15 g/L，因为有少量的克罗诺杆菌，能在显色剂浓度为0.10 g/L 的阪崎肠杆菌显色琼脂（Brilliance Enterobacter sakazakii Agar ，DFI配方）上生长，但不能形成蓝绿色菌落，却能在CCI上呈现典型的蓝绿色菌落。
4、生化鉴定
首先，新标准对疑似菌落在胰蛋白胨大豆琼脂(trypticase soy agar，TSA) 上纯培养的温度范围，也扩大至34℃～38℃。并且规定，进行疑似菌落纯培养后的TSA平板，可在5℃保存不超过七天，这显然有利于对疑难菌落进行反复鉴定。
其次，对产黄色色素的鉴定，ISO 22964：2017 不再采用纯菌划线接种TSA后，在25℃±1℃培养48 h的方法。而是在纯菌的悬液中加入4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷，37℃水溶培养4 h后，于405 nm处测定吸光度。该方法对阳性结果鉴定节约了44 h的时间，既提高了工作效率，又提高了检出率。
因为有研究发现，大约8%的克罗诺杆菌不能在TSA上形成黄色菌落，但用新的鉴定方法发现能产黄色色素。
另外，新标准把氨基酸脱羧酶试验和糖发酵试验的温度，从30℃±1℃改为37℃. 并且将L-精氨酸双水解酶试验、L-鼠李糖发酵试验、D-蜜二糖发酵试验、苦杏仁甙发酵试验、柠檬酸水解试验从生化鉴定项目中删除，只是增加了D-阿拉伯糖发酵试验。这样，生化鉴定变得更为简捷。
5、其他
在新标准的附录B中给出了灭菌后的培养基与试剂的保存期限，这是ISO标准的新规定，对微生物检验人员帮助较大。下表列出一些常见培养基与试剂在灭菌后的保存期限。
此外，ISO 22964：2017中的标准菌株采用了世界微生物数据中心(World data center for microorganisms，WDCM)的编号。为方便不同国家用户使用ISO推荐的标准菌株，推动全球菌种资源的高标准应用，ISO新制修订的食品微生物标准中的标准菌株均采用了WDCM的编号。用户可在WDCM官网(http://refs.wdcm.org/)上查找编号，并可检索到分布于不同国家、不同保藏机构的等同菌种编号。
据了解，目前有约50家经严格确认的专业菌种保藏机构，加入了WDCM，其中包括我国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)和普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
叁
ISO 22964：2017的学习体会
1、“以人为本”， ISO 22964：2017扩大了前增菌的温度范围，改用CSB作为选择性增菌液，删减了生化鉴定的项目，采用更为快速的产黄色色素的鉴定方法，规定了灭菌后培养基的保存期限。
这些新的变化增强了标准的适用性，降低了劳动强度，提高了工作效率。给标准的使用者既带来了方便，又提供了更加实用的指导。
2、“用数据说话”， ISO 22964：2017中所有的技术性修改，都是基于权威文献的报道和协同试验的研究结果，这点特别令人信服，也特别值得我们学习。
参考文献：
1. ISO/TS 22964：2006. Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii
2. ISO 22964：2017 .Microbiology of the food chain. Horizontal method for the detection of Cronobacter spp..
3. Iversen C., Lehner A.,Mullane N., et al. Identification of cronobacter spp (Enterobacter sakazakii) [J]. J. Clin. Microbiol. 2007, 11(45):3814-3816.
4. Iversen C., Druggan P., Schumacher S., et al. Development of a novel screening method for the isolation of cronobacter spp (Enterobacter sakazakii) [J]. Appl. Evironm. Microb. 2008, 8(74):2550-2553.
