微生态制剂又称活菌制剂或微生态调节剂，是指在微生态理论指导下，调整微生态失调，保持微生态平衡，提高宿主健康水平或增进健康状态的益生菌及其代谢产物和生长促进物质的制品。目前微生态制剂主要包括益生菌、益生元、合生元三种类型[1]。二十世纪中叶，日本、法国等国家最先开始利用一些外来对人无毒无害的微生物（如双歧杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌等）制成活菌制剂，它们在人体肠道内能促进正常菌群的生长繁殖，调整肠内微生态平衡，防治菌群失调引起的腹泻等疾病[2]。
近年来，随着微生态学理论的发展，运用微生态学知识为人类健康服务已逐渐被国人所认识，微生态制剂应运而生，并发展迅速，目前已研制开发出百余种产品，包括食品、保健食品和药品等。药品市售剂型主要集中在胶囊剂、片剂、口服液、粉剂，在研剂型主要集中在肠溶胶囊、微胶囊剂和靶向制剂[3,4]，目前约20%的微生态制剂作为临床治疗用生物制品。自九十年代以来我国先后已有22种微生态活菌制剂取得国家新药证书，如丽珠肠乐（双歧杆菌）、金双歧（双歧杆菌）、整肠生（地衣芽胞杆菌）、抑菌生（枯草芽孢杆菌）、培菲康（双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪链球菌）等制剂[5]。常用的微生物态制剂菌种主要包括双歧杆菌、乳酸杆菌、酪酸梭菌、嗜热链球菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等[6]。
2.微生态制剂中活菌计数方法学探讨
评价微生态活菌制剂安全有效的重要质控指标之一是活菌数测定。中国药典对微生态活菌制品的活菌数测定规定为无菌称取样品3.0克，加入27.0 mL稀释液，之后稀释涂布在选择性琼脂培养皿上测定。活菌数测定方法应尽量真实的反应样品中的活菌数。影响计数方法准确性的因素主要包括培养基、培养条件、培养时间和供试液的制备等。
药典规定培养基应为选择性琼脂培养基，是指最适宜制剂（或菌粉）中活菌生长的培养基，且须经培养基适用性检查合格后方可使用。笔者在进行地衣芽孢杆菌颗粒剂活菌数测定方法学验证时，曾经比较了不同厂家的营养琼脂，按药典规定进行培养基适用性检查都合格，但是在进行活菌计数时，有个别厂家营养琼脂培养基的计数结果明显偏低，所以活菌计数方法学验证时对培养基的考察非常重要[7]。方法学研究时也发现某些样品菌对培养基的pH值非常敏感，如酸性和碱性环境都会抑制地衣芽孢杆菌的生长，因此应调节培养基的pH值至适合样品菌生长的范围。多联的微生态活菌制品必要时应考虑培养基的选择性，一般采用不同的选择性培养基通过抑制某些微生物后进行分别计数；单联的微生态活菌制品尽量选择非选择性培养基，如同类培养基结果一致时应选择性价比高的培养基。
活菌计数培养条件包括培养温度、培养方式和培养时间等。培养温度可参考2015年版《中国药典》四部通则需氧菌总数培养温度和国标中同类菌培养温度；培养方式根据菌种特性选择需氧、厌氧或者微需氧。培养时间的确定可通过绘制活菌数随培养时间变化趋势图进行评估。
供试液的制备是影响活菌计数结果的关键因素，充分混匀样品对准确测定活菌数至关重要。一般供试液制备需考虑样品的混匀方式，混匀方式有振荡混匀、匀浆混匀等。如样品采用振荡混匀，则需考察振荡时间，同时也需结合混匀样品的容器确定振摇频率。振荡混匀制备供试液时可添加适量的无菌玻璃珠，且混匀供试液和10倍梯度关系稀释时振摇时间不能太短，以防止样品未混均匀对计数结果造成影响。如样品采用匀浆混匀，应考察匀浆速率和匀浆时间等影响因素。
如活菌制剂的原料菌粉在制备过程中使用了碳酸钙类的易沉颗粒，则需在供试液制备时添加一定浓度的表面活性剂（如吐温-80），防止辅料快速沉降影响计数结果。
3.微生态制剂中杂菌检查方法学研究及标准探讨
中国药典2015年版三部附录3《微生态活菌制品杂菌检查法》中杂菌检查包括控制菌检查、非致病性杂菌和真菌计数[8]。控制菌检查是定性测定产品中是否污染特定致病菌或者条件致病菌，根据用药途径不同检查不同的致病菌，主要包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、志贺菌、梭菌和白色念珠菌。非致病性杂菌是定量测定产品中污染的杂菌，以口服微生态活菌制品为例每g中不超过1000 CFU；真菌计数是定量测定产品中污染的真菌，以口服微生态活菌制品为例每g中不超过100CFU。
2015年版中国药典三部附录3虽列出微生态活菌制品杂菌检查法的一般规定，但并没有列出各个品种项下不同活菌制剂杂菌检查法的具体检测方法。为了安全有效地控制微生态活菌制剂的质量，应对微生态活菌制剂的杂菌检查方法开展相关的方法学研究。控制菌检查采用增菌培养后划线至选择性平板培养鉴定。笔者曾对地衣芽孢杆菌活菌制品和蜡样芽孢杆菌活菌制品进行控制菌检查方法学研究，发现活菌制品在药典规定的有些鉴定培养基平板上也会生长，且因为样品中含活菌数量巨大，会对鉴定培养基显色造成影响。中国药典中非致病性杂菌检查是采用选择性培养基对样品进行涂布后培养计数。笔者对上述两个品种的非致病性杂菌检查进行方法研究时，由于样品中活菌数高达十几亿，而非致病性杂菌的菌落数限度仅为样品的百万分之一。在非选择性平板上巨量的有效活菌会掩盖计数平板中的杂菌，因此进行非致病性杂菌计数非常困难[9]。若采用选择性培养基对活菌制剂进行非致病性杂菌计数，选择性培养基除抑制目的菌外，一般也会抑制其他非致病性杂菌。然而目前尚无法找到一种培养体系可以促生长除产品中有效活菌之外的所有非致病性杂菌。
笔者认为口服微生态活菌制品的非致病性杂菌数限度应与微生态制剂产品本身活菌浓度相比，所以应以杂菌率作为限度指标比较适宜。例如可参照中国农业行业标准（微生物饲料添加剂-地衣芽胞杆菌 NY/T 1461-2007）规定，以地衣芽孢杆菌的杂菌率不得过0.1%为限度指标[10]。杂菌率是指杂菌占总菌数的百分率，即杂菌率(％)=杂菌数/（功能微生物的有效活菌数+杂菌数）×l00。此限度杂菌率的检查可按照中国药典规定采用营养琼脂培养基用于非致病性杂菌的计数。具体操作是将样品稀释至含样品活菌数约1000 CFU·mL-1，然后取1 mL平均分至5个营养琼脂平板中，涂匀培养后分别计数杂菌数和有效活菌数。笔者采用此方法对地衣芽孢杆菌颗粒和蜡样芽孢杆菌活菌片两个品种的非致病性杂菌检查进行方法学研究，结果证明该方法准确可行，可作为同类微生态制剂产品质量控制的参考。此外作为活菌制剂产品，不同规格产品中的活菌浓度差异较大，因此达到药效浓度的剂量差异也对应较大，如果产品标准中参照口服药微生物限度标准，仍然以单位重量的绝对杂菌数进行产品的质量控制显然并不科学。因此药典中口服微生态活菌制品成品非致病性杂菌数不得超过1000 CFU·g-1这一限度指标仍值得进一步研究[9]。
4.新技术的进展
传统微生物培养计数方法存在着培养时间长、操作繁琐等问题，随着快速微生物检测方法的发展，新技术如PCR技术和荧光标记技术等开始应用于微生物活菌计数[11,12]，笔者也曾考察基于标记微生物和流式细胞计数原理的流式细胞仪进行微生态活菌制剂的活菌数测定，结果显示与平板培养方法的计数结果无显着性差异。中国药典在2010年已经增加关于药品微生物检验替代方法验证指导原则，因此考察快速准确的新技术替代传统的微生物培养计数方法也是微生物检测技术发展的趋势。
参考文献
[1]李云珠,俞善昌.抗生素的弊端与益生素的兴起[J].中华儿科杂志,1994,32(1):53-55.
[2]袁佩娜. 微生态制剂的质量控制要求[J].中国微生态学杂志,2002,14(4):187-188.
[3] LI Liang,WEI Qing-mei,DU Peng, et al.Application of microencapsulated Bifidobacterium teenology[J].China Dairy Indust.2004.32(1)47-50.
[4] Yu Lian.YANG Jing-yun.SUN Wei-tong, et al.In vitro release and localization study of synbiotics colonic targeting microecdogical medulator[J].Chin J Microecol,2010,22(1):29-35.
[5]于莲,马丽娜,杜妍,等.微生态制剂研究进展[J].中国微生态学杂志,2012,24(1):84-86.
[6]董沛晶.微生态制剂的应用研究进展[J].现代临床医学,2017,43(2):91-93.
[7]郑小玲,阮昊,陈爽,等.地衣芽孢杆菌活菌颗粒活菌数测定方法的建立 [J].药物分析杂志,2014 , 39 (10) :1792-1795.
[8]中国药典2015年版.三部［S］2015: 微生态活菌制品总论 附录3.
[9]郑小玲.陈爽,章鑫萍,等.地衣芽孢杆菌活菌颗粒杂菌检查方法验证的研究[J].中国现代应用药学,2015 , 32 (3) :339-343.
[10]中华人民共和国农业行业标准[S],NY/T 1461-2007,微生物饲料添加剂-地衣芽胞杆菌.
[11] Davis C.Enumeration of probiotic strains: Review of culture-dependent and alternative techniques to quantify viable bacteria[J]. J Microbiol Me,2014, 9(17):13.
[12] Maukonen J, Alakomi H L, Nohynek L, et al. Suitability of the fluorescent techniques for the enumeration of probiotic bacteria in commercial non-dairy drinks and in pharmaceutical products
[J]. Food Res Int, 2006, 39(1): 22-32.
