来自吉林农业大学食品科学与工程学院的王鹏、王明爽和刘春雷等人在确定分子质量小于3 kDa的多肽具有较好免疫调节活性的基础上，通过凝胶色谱、反相高效液相色谱（RP-HPLC）和飞行质谱对其进行分离纯化和结构鉴定，并对获得的六肽进行验证，为榛仁免疫活性肽的开发和利用提供依据。
01
Sephadex G-25分离
分子质量小于3 kDa 的组分经SephadexG-25分离后得到A1、A2和A3，共3 个组分。A1组分样品太少，不足以进行后续分析，故对A2和A3两个组分进一步分离纯化。
02
Sephadex G-15分离
A2组分经Sephadex G-15分离，得到B1、B2和B3，共3 个组分，图3中A3组分经分离后得到B4、B5、B6和B7，共4 个组分。收集冻干，测定其免疫活性。
03
凝胶层析组分细胞毒理性
Sephadex G-15凝胶层析组分细胞毒理性巨噬细胞后在一定质量浓度下能显着提高细胞活性，其他组分对细胞活性影响不显着（P＞0.05）。与空白组和LPS组相比，B1～B7组分，在不同质量浓度下经LPS共同刺激RAW264.7巨噬细胞后，细胞活性没有显着差异（P＞0.05）。说明样品在质量浓度为10、50、100 mg/L时对细胞没有明显毒性，选此质量浓度进行后续实验。
04
对巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6的影响
与空白组相比，各组分细胞因子TNF-α的分泌量随着质量浓度的增加而降低。与LPS组相比，除B6组外，各组分在高质量浓度极显着地抑制巨噬细胞分泌的TNF-α的产生（P＜0.01）。
与LPS组相比，B1、B5、B6组分对LPS活化后的巨噬细胞分泌的IL-6含量均有极显着地抑制作用（P＜0.01）；B2、B3、B4组分在100 mg/L时对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞产生IL-6分泌量有极显着地降低作用（P＜0.01）；而B7组分在100 mg/L时，对IL - 6的分泌量有显着地降低作用（P＜0.05）。结果表明，B1、B5、B6组分在该质量浓度范围内能极显着抑制IL-6的产生（P＜0.01），进而调节机理免疫功能。
05
活性肽的分离与鉴定
组分B1经RP-HPLC分离后，得到C1、C2、C3和C4，共4 个组分。将C4收集后，经一级质谱和二级质谱鉴定获得多肽氨基酸序列。根据质谱结果和肽段序列可信度及构效关系筛选出1 个多肽，分子质量为791.82 Da，氨基酸序列Pro-Glu-Asp-Glu-Phe-Arg。
06
PEDEFR对巨噬细胞增殖能力等的影响
与LPS组相比，PEDEFR在该浓度范围内对细胞存活率无显着性差异（P＞0.05），说明PEDEFR对细胞无毒害作用，因此选择12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L进行下一步实验。与空白组相比，PEDEFR在50 μmol/L和100 μmol/L时可以极显着促进巨噬细胞吞噬中性红（P＜0.01），且表现为浓度依赖关系。
07
PEDEFR对脾淋巴细胞增殖能力的影响
与100 μmol/L PEDEFR相比，50 μmol/L对淋巴细胞增殖率的影响无显着性差异（P＞0.05），与低浓度（＜50 μmol/L）相比差异极显着（P＜0.01）。各个浓度PEDEFR对淋巴细胞增殖均有促进作用，并呈浓度依赖性，在100 μmol/L时，增殖率达到44.21%。与100 μmol/L PEDEFR和ConA共同作用相比，50 μmol/L对淋巴细胞增殖率的影响无显着性差异（P＞0.05），与低浓度（＜50 μmol/L）相比差异极显着（P＜0.01），在100 μmol/L时增殖率达到53.22%。在ConA刺激下淋巴细胞增殖能力显着提高（P＜0.01）。结果表明，PEDEFR能刺激淋巴细胞增殖，并呈一定浓度依赖性，且高浓度比低浓度效果明显。
结 论
经Sephadex G-15分离得到的组分B1能极显着降低小鼠RAW264.7巨噬细胞肿瘤坏死因子和白介素-6水平（P＜0.01）；经质谱解析筛选出的肽段Pro-Glu-Asp-Glu-Phe-Arg（PEDEFR）对细胞无毒性作用，高浓度PEDEFR（＞50 μmol/L）能提高小鼠RAW264.7巨噬细胞吞噬能力；当浓度达到100.0 μmol/L时，促进脾淋巴细胞增殖率达到44.21%，在伴刀豆蛋白A共同作用下，增殖率达到53.22%。PEDEFR对小鼠RAW264.7巨噬细胞具有较好的免疫调节能力，本研究为榛仁免疫活性肽的开发提供了理论依据。
