来自中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心的潘艳仪、邱德义和陈健等人针对常见的经济动物物种，基于coi基因序列设计了一对通用引物，结合微型DNA条形码和克隆测序技术对混合的肉样品成分实现一次性准确、高效的鉴定。以便进一步应用于未知成分的肉糜制品或深加工肉类食品的多种肉源性成分的检出。
1. 引物的通用性分析
28 个属中，共有14 个属具有较高同源性（少于2 个差异位点）：猪属、雁属、鲇鱼属、马头鱼属、非鲫属、鲤鱼属、石鸡属、鲶鱼属、圆鯵属、草鱼属、鲢鱼属、鲫鱼属、长臂虾属和黄牛属。有4 个属具有较低同源性（4～5 个差异位点）：黄鳝属、对虾属、龙虾属和白虾属。其余的10 个属具有中等的同源性（3 个差异位点）。为了进一步检验引物的适用性和通用性，选取源于3 种不同的同源性水平的11 个物种（表1中以上标“1”标记）进行后续的实验验证。
2. 样品物种的鉴定
经DNA条形码分子鉴定，11 个样品的目的序列都能与BOLD条形码数据库的参考序列达99.8%以上的相似度，达到物种鉴定的标准，确定样品的物种如下：鲶鱼、草鱼、马头鱼、蓝圆鲹、原鸡、石鸡、黄牛、水牛、家猪、绵羊和凡纳滨对虾。
3. 微型DNA条形码鉴定物种的准确性
测序后返回的DNA序列经序列处理和分析，并蛋白质翻译校对无误后，结合BOLD数据库的参考序列和GenBank的匹配序列，所有目的片段和对应的两种序列都有100%的相似度，即对每个物种的鉴定都准确地达到了种的水平。
4. 混合肉样品的克隆测序结果
H组3 个平行的混合肉样品中的390 个阳性克隆经过Sanger测序后，其中绝大部分的阳性克隆都能被成功测序并获得高质量的测序结果，只有3.6%的阳性克隆测序失败或者序列比对结果不佳，说明本实验的克隆测序法的阳性克隆具有较高的有效性。经序列处理和序列分析后，各物种的微型条形码序列（136 bp）几乎都能与数据库中的参考序列达到100%的相似度，说明微型条形码与克隆测序法结合后，对物种鉴定依然具有较高的准确度。综合3 个平行样品，除了原鸡和蓝圆鲹，其余9 个物种皆一并检出。进一步分析各个物种的序列丰度，不同物种之间被检出的概率差异较大。混合样品中鲶鱼、石鸡、黄牛和绵羊物种的检出概率较高，其检出概率的范围为7.7%～54.0%，而其余物种的检出概率的范围为0%～1.5%（按3 个平行样品物种序列数的均值计算）。
5. 微型条形码与标准条形码的NJ树的比较分析
28 个不同的属（每个属已在前文中一一列举）都能得到明确的区分。除了原鸡属、雁属、亚口鱼属、罗非鱼属和绵羊属内的物种序列之间有较高的相似度，其他的21 个属内各物种的种间距离基本都大于2%，达到了物种区分的界限。属内种间差异较小的物种有：原鸡和灰原鸡，雪雁、豆雁、灰雁和白额雁，莫桑比克罗非鱼和尼罗罗非鱼，黑鲫和鲫鱼，扁吻亚口鱼和圣安娜亚口鱼，银鲳鱼和翎鲳鱼以及落基山脉大角羊和白大角羊。另一方面，除银鲳鱼外，其余的50 个物种种内的不同个体的序列之间都拥有高于98%的相似度，即个体差异小于种间差异，达到种内保守。标准条形码的NJ树的各属内物种差异较小的物种较少，但原鸡属、雁属及绵羊属内的种间差异也小于2%。种内个体差异较大的物种较多，包括了银鲳鱼、阿氏六须鲶和鲢鱼。
结 论
引物有较好的通用性，能对具有不同的引物同源性水平的11 个物种进行有效扩增并获单一条带。微型条形码能准确鉴定11 个肉类物种，与常规DNA条形码鉴定效果一致。经克隆测序法，把混合样品的9 个物种一并检出，总体上达到了较高的检出效率，同时深入讨论了未能检出全部物种的原因。微型条形码良好的物种鉴定能力的研究结果为联合微型DNA条形码与二代测序技术进行混合样品中物种的高效鉴定提供参考依据。
