重庆大学化学化工学院的江 文、周 桢、李晓辉等人以市售萝卜红色素为原料，先进行分离纯化，制备出纯化萝卜花青素，再用葡萄糖苷酶对其进行酶法修饰，获得修饰物。探究修饰物的结构，并用正交试验法确定其最佳修饰条件，验证其冷水溶解性、抗氧化能力以及对人肝癌细胞株MHCC97L的生长抑制作用。旨在提供一种制备冷水可溶性良好的功能性萝卜红色素衍生物的方法和产物。
1、萝卜花青素结构分析
纯化萝卜花青素仅有一个主峰，出峰时间为4.97 min，峰面积占92.6%。这说明使用膜分离和XAD-4大孔树脂可以制备出纯度较高的萝卜花青素。出现了m/z分别为448、433、339等峰，萝卜花青素黄酮母核相对分子质量为287，萝卜红色素单糖苷的相对分子质量为449，萝卜花青素双糖苷的相对分子质量为611，形成质子化准分子负离子m/z为610，与图谱中的610处峰对应；其先失去一个羟基之后的碎片负离子m/z 590，对应图谱中589处峰；继续丢失B环后的碎片负离子m/z 482，对应图谱中480处峰。萝卜花青素双糖苷失去一个羟基再失去一个糖苷后的碎片负离子m/z为449，对应图谱中448处峰；继续丢失B环后的碎片负离子m/z 340，对应图谱中340处峰，说明纯化萝卜花青素中的主要物质为萝卜花青素双糖苷。
2、萝卜花青素酶修饰物的表征
红外光谱分析
在D区（1 639、1 599、1 513、1 445 cm－1）的吸收峰为萝卜花青素中苯并吡喃的芳环和杂环的骨架振动，B区（1 268、1 173、1 073 cm－1）的吸收峰为糖环中碳氧键的伸缩振动吸收峰（C—O—C）。纯化的萝卜花青素A区（834 cm－1）为吡喃糖苷的特征吸收峰，C区（1 336 cm－1）吸收峰为2 个糖环之间的碳氧键伸缩振动吸收峰（C—O—C），而萝卜花青素酶修饰物A区处吸收峰明显减弱，C区处吸收峰消失，且在B区处吸收峰强度明显弱于纯化的萝卜花青素。这说明一分子葡萄糖从萝卜花青素分子中被葡萄糖苷酶成功水解。
质谱分析
萝卜花青素单糖苷相对分子质量为449，形成质子化准分子负离子m/z为448，与图谱中的448处峰对应；萝卜花青素单糖苷失去一个羟基之后的碎片负离子m/z 433，对应图谱中432处峰；继续丢失B环后的碎片负离子m/z 339，对应图谱中339处峰。
3、萝卜花青素酶修饰条件优化结果
单因素试验结果
结果可知，当pH值在2～5区间时，萝卜花青素酶修饰物产率随着pH值升高而增加；当pH值超过5，产率则随pH值升高而降低。葡萄糖苷酶/萝卜花青素质量比为0.001∶1时，酶修饰物产率为50.28%；当葡萄糖苷酶/萝卜花青素质量比增加到0.005∶1时，酶修饰物产率达到72.61%，再增加葡萄糖苷酶比例，酶修饰物产率呈水平线趋势，增长缓慢，初步确定葡萄糖苷酶/萝卜花青素的质量比在0.005∶1～0.01∶1之间。在反应温度为30～40 ℃区间内，酶修饰物产率随着反应温度的升高而增加；在温度区间40～50 ℃时，酶修饰物产率增长变缓；当温度区间为50～60 ℃时，酶修饰物产率随着反应温度的升高而逐渐降低；继续增加温度，酶修饰物产率急速下降。
制备萝卜花青素酶修饰物的正交试验结果
正交试验结果
因素A对试验结果有极显着影响，因素C对试验结果有显着的影响，这主要归因于pH值和反应温度显着影响葡萄糖苷酶的活性；因素B对试验结果无显着影响。考虑到正交试验的结果，选择A2B2C2为最优组，即pH 5.0、葡萄糖苷酶/萝卜花青素质量比0.007∶1、反应温度50 ℃为最优方案。
验证实验结果
采用优化后的工艺条件，反应时间为80 min进行3 次验证实验，测得萝卜花青素酶修饰物产率为74.86%，优于正交试验中的任何一个组合，故确定pH 5.0、葡萄糖苷酶/萝卜花青素质量比0.007∶1、反应温度50 ℃为葡萄糖苷酶修饰萝卜花青素的最优条件。
4、萝卜花青素酶修饰物溶解性
该糖配基除难以形成分子内氢键外，形成分子间氢键的数量和能力也显着降低，这反过来又削弱了天竺葵素母核间形成平面疏水相互作用的能力，故萝卜花青素二糖苷的糖苷酶修饰物-萝卜花青素单葡萄糖苷的冷水可溶性显着提升，在4 ℃冷水中的溶解率至少提升53.57%，在65%乙醇溶液中的溶解率至少提升36.93%。
5、萝卜花青素酶修饰物的抗氧化能力
萝卜花青素、酶修饰物和原花青素B2的羟自由基清除能力都随着抗氧化剂的浓度增大而增大。当抗氧化剂浓度相同时，酶修饰物的羟自由基清除率明显高于萝卜花青素，但是略低于原花青素B2。
6、萝卜花青素酶修饰物对MHCC97L细胞的生长抑制作用
用浓度为5～40 μmol/L的萝卜花青素酶修饰物处理人体肝癌细胞MHCC97L 24～72 h，均可显着抑制该细胞的生长，抑制率随其剂量增加而增大。
结 论
利用膜分离和XAD-4大孔吸附树脂纯化萝卜红色素粗品，获得主要成分为萝卜花青素二糖苷的纯化萝卜花青素。用纯化糖苷酶修饰纯化萝卜花青素，以萝卜花青素酶修饰物产率为指标进行工艺条件优化，研究pH值、葡萄糖苷酶/萝卜花青素质量比、反应温度3 个工艺参数对糖苷酶修饰萝卜花青素的影响，确定了糖苷酶修饰萝卜花青素的最佳工艺条件为pH 5.0、葡萄糖苷酶/萝卜花青素质量比0.007∶1、反应温度50 ℃，在此优化条件下萝卜花青素酶修饰物产率可达74.86%。进而验证萝卜花青素酶修饰物的溶解性，其在4 ℃冷水和65%乙醇溶液中的溶解率分别较纯化萝卜花青素提高115.38%和58.55%。抗氧化能力分析表明，萝卜花青素酶修饰物对羟自由基具有良好的清除能力。此外，用浓度为5～40 μmol/L的萝卜花青素酶修饰物处理人体肝癌细胞MHCC97L 24～72 h，均可显着抑制该细胞的生长，抑制率随其剂量增加而增大。
