徐州工程学院食品（生物）工程学院的高兆建、王先凤、芦 宁等人分离到1 株高产菊粉酶的宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）菌株，所产菊粉酶高温高酸环境下稳定性强、活性高。能够在pH 4.0、温度60 ℃下进行高效菊糖水解反应，有望在果糖的工业化生产中应用。高兆建等人主要从菌株发酵液中分离纯化菊粉酶，并对菊粉酶的水解特性、稳定性等理化性质深入研究，旨在为应用于高果糖浆制备所使用的菊粉酶来源提供新途径，为菊粉酶的高效应用提供参考。
1、菊粉酶的柱层析分离纯化
可以看出，菊粉酶在pH 6.0缓冲溶液中，能够结合到离子交换介质上。通过不同的盐离子浓度，可以有效同大部分杂蛋白分开，并将粗酶液中的色素去除。离子交换层析后，酶液比活力为52.07 U/mg，纯化倍数为6.02 倍，回收率为62.31%。整体看离子交换层析纯化效率高。
2、纯化过程蛋白的SDS-PAGE分析
硫酸铵沉淀后经透析样品含有最多的蛋白条带，说明杂蛋白含量很高；经过离子交换层析后的样品，蛋白条带显着降低，但仍有多条蛋白带存在，说明离子交换层析对分离杂蛋白效果显着，但也没有得到单一的蛋白；再次经过分子筛凝胶过滤层析后，得到单一蛋白条带，表明纯化后的几丁质酶达到电泳纯，同时说明菊粉酶为单一亚基。
3、纯化菊粉酶酶学特性分析
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酶的最适反应pH值及pH值稳定性
菊粉酶具有很宽的pH值稳定性范围，在pH值为3.5～10.0时，残余酶活力均能达到80%以上；pH值低于3.5和超过10.5则变得不稳定，pH值超过10.5时，残余酶活力急速下降。该酶有良好的pH值稳定性，在工业生产中有良好的发展前景。
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酶的最适反应温度及热稳定性
在30～80 ℃范围内，菊粉酶均能保持较高活力，当温度高于80 ℃处理后的酶液，活性开始迅速下降。在70 ℃以下，保温1 h后，残余酶活力均能保持80%以上。
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不同金属离子和抑制剂对菊粉酶活力的影响
金属螯合剂EDTA对菊粉酶活力有较强的抑制作用，10 mmol/L浓度下，残余酶活力为75.6%；还原剂β-巯基乙醇和DTT在1 mmol/L浓度下，对酶活力有显着抑制作用，β-巯基乙醇抑制率达到33%；而表面活性剂SDS、Tween 80和Triton X100对酶活力基本没有影响；有机溶剂乙醇在3 个检测体积分数下均没有抑制作用。
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菊粉酶动力学分析
将稀释的菊粉酶纯酶液分别与不同浓度的菊糖底物反应，测定生成的还原糖量。根据Lineweaver-Burk作图法，分别求出酶的Km值及Vmax值，菊粉酶的Km值为5.93 μmol/L，Vmax为75.18 μmol/（min·L）。
结 论
以宛氏拟青霉XS27为菌种，经过初步的三角瓶液体发酵，以菊糖为底物，最适水解条件下，检测菊粉酶活力达到56.7 U/mL。在均以菊糖为底物、最适酶解条件及相同的酶活力单位计算方法情况下，对比国内外菊粉酶发酵活力发现，本研究的菊粉酶产量在非重组菌株中处于较高水平。采用离子交换层析、分子筛过滤层析等方法从宛氏拟青霉XS27发酵液中纯化到了电泳纯的菊粉酶并对酶的性质进行研究。纯化酶比活力为327.4 U/mg，纯化倍数37.85，回收率达到51.52%。对比国内外菊粉酶纯化方法，本研究的纯化体系从酶的纯化倍数及酶活力的回收率来看都具有显着优势。此外，由于该纯化方法所需时间短，工艺操作简单，纯化效率高，因此可以适用于高纯度酶制剂的工业化生产。菊粉酶具有优良的理化特性，在较高的温度及宽广的pH值范围内，能保持较高的稳定性；在pH 4.0及温度60 ℃下，水解菊糖活性最佳。因此该酶是一种嗜酸嗜热型的菊糖专一外切型水解酶。另外，酶对表面活性剂及乙醇具有较好的耐受性。综合来看，菊粉酶具有优良的理化性质，很有希望在食品、医药、日化行业中用于果葡糖浆制备、淀粉质的彻底水解、低聚果糖合成、乙醇发酵中。
