为探讨甘南夏河藏区曲拉酶解产物的抗氧化性，甘肃农业大学食品科学与工程学院的刘倩霞、杨富民*、赵保堂*等人以碱性蛋白酶和胰蛋白酶作为水解酶，以水解度为指标，采用响应面法优化2 种蛋白酶酶解曲拉干酪素的条件，通过测定酶解产物超氧阴离子自由基、羟自由基清除率等抗氧化性指标比较2 种酶酶解曲拉干酪素溶液的抗氧化能力。本研究旨在明确碱性蛋白酶和胰蛋白酶曲拉干酪素酶解液抗氧化性的差异，为曲拉干酪素酶解工艺以及产物的进一步利用提供依据。
1、单因素试验结果
随着酶解时间的延长，碱性蛋白酶在0～3.5 h、胰蛋白酶在0～2.5 h内，水解度均呈上升。碱性蛋白酶在3.5 h达到最大，水解度为24.97%，胰蛋白酶则在2.5 h达到最大，水解度为12.29%。之后随着时间延长，2 种酶的水解度均稍有下降，但变化均不明显（P＞0.05）。其原因可能是因为在酶解初期，由于酶切位点较多，导致水解度上升趋势明显，而随着酶解时间不断延长，暴露的酶切位点相对较少，使反应速率逐渐下降，反应趋势减弱。
2、响应面试验结果
碱性蛋白酶
综合单因素及响应面试验结果，碱性蛋白酶酶解曲拉干酪素的优化工艺参数为酶解时间3.84 h、酶解温度49.84 ℃、酶添加量139.37 U/g、pH 8.54，预测值为24.88%，按最优条件为碱性蛋白酶酶解时间3.8 h、酶解温度49.8 ℃、曲拉干酪素质量浓度60 g/L、pH 8.5、酶添加量140 U/g，验证实验（n=3）得水解度为24.25%。
胰蛋白酶
综合以上单因素及响应面试验结果，胰蛋白酶优化工艺参数为酶解时间2.53 h、酶解温度47.79 ℃、酶添加量2 882.00 U/g、pH 7.50，水解度预测值为13.80%，按最优条件为胰蛋白酶酶解时间2 . 5 h 、酶解温度47.8 ℃、曲拉干酪素质量浓度35 g/L、pH 7.5、酶添加量2 900 U/g，验证实验（n=3）得水解度为13.57%，实验值与预测值基本切合。
3、2 种蛋白酶酶解液抗氧化性
超氧阴离子自由基清除能力
随着酶解液质量浓度的增大，酶解液的清除能力呈上升趋势。其中，酶解后胰蛋白酶的清除能力显着（P＜0.01），胰蛋白酶超氧阴离子自由基清除率从74.05%上升到82.07%，增大8.02%（P＜0.05），碱性蛋白酶组从67.31%上升到77.27%，增大9.96%（P＜0.01），曲拉干酪素溶解液（对照）增加不明显（P＞0.05）。歧化和其他类型的反应可产生H2O2和羟自由基，使清除能力增强，2 种酶均能够显着提高水解度，产生的小分子质量肽段增多。
羟自由基清除能力
随着酶解液质量浓度的增大，酶解液的羟自由基清除能力呈现上升趋势，但2 种蛋白酶无显着性差异（P＞0.05）。羟自由基可以与细胞中几乎所有的物质发生反应，从而诱导产生对细胞的严重破坏。
DPPH自由基清除能力
5.0 mg/mL碱性蛋白酶解液DPPH自由基清除率较1.0 mg/mL提高18.32%，显着高于胰蛋白酶（P＜0.01）。胰蛋白酶组结果增长缓慢，趋势平缓，清除能力不到30%，2 种蛋白酶之间差异显着（P＜0.01）。碱性蛋白酶较胰蛋白酶清除效果更佳，可能是因为碱性蛋白酶主要酶解疏水性的氨基酸，电子供体存在于酶解液中，自由基与之反应结合为稳定产物。
还原力
酶解液还原力随着酶解液质量浓度的增加而增大，碱性蛋白酶在1.0 mg/mL时为0.46，5.0 mg/mL达到0.64，增大26%（P＜0.01）；胰蛋白酶从1.0 mg/mL时的0.11增大到5.0 mg/mL的0.29，增大62%（P＜0.01），相比于曲拉干酪素溶解液和胰蛋白酶，碱性蛋白酶组的增加显着（P＜0.05），但增加趋势胰蛋白酶明显优于碱性蛋白酶（P＜0.01）。
Fe2＋螯合能力
酶解液对Fe2＋的螯合能力随着酶解液质量浓度增加而增加。对于碱性蛋白酶，当酶解液质量浓度从1.0 mg/mL增加到5.0 mg/mL时，螯合能力从20.93%增加到59.32%（P＜0.01），胰蛋白酶则从50.25%增加到78.60%（P＜0.01）。
Cu2＋螯合能力
随着酶解液质量浓度的增加，Cu2＋螯合能力逐渐增大，碱性蛋白酶组从44.52%增大到59.65%，增大15.13%（P＜0.05），胰蛋白酶组从45.67%增大到57.18%，增加11.51%（P＜0.05），与曲拉干酪素溶解液相比均显着增大（P＜0.01），但2 种蛋白酶之间差异不显着（P＞0.05）。
结 论
采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶对曲拉干酪素进行酶解，通过单因素和响应面试验优化，分别在酶解时间3.8、2.5 h、酶解温度49.8、47.8 ℃、曲拉干酪素质量浓度60、35 g/L，pH 8.5、7.5，酶添加量140、2 900 U/g时水解度较高。
曲拉干酪素碱性蛋白酶和胰蛋白酶2 种酶解液，均表现出良好的抗氧化性和电子或氢供体能力。通过对抗氧化性的比较，清除羟自由基、DPPH自由基能力和还原力的效果碱性蛋白酶相对较好，超氧阴离子自由基清除效果则胰蛋白酶解液优于碱性蛋白酶解液。金属螯合能力方面，碱性蛋白酶解液Cu2＋螯合能力优于胰蛋白酶解液，而Fe2＋螯合能力则相反。碱性蛋白酶酶解曲拉干酪素的水解度明显优于胰蛋白酶，更适宜用于曲拉干酪素的酶解。随着对曲拉干酪素抗氧化肽活性功能研究的深入，需要对不同分子质量肽段进行分离、纯化、鉴定，明确其肽序列，深入研究肽的结构和特定的抗氧化机制及动物体抗氧化性效果等。
