脑神经细胞是组成脑神经系统的基本功能单位,其正常的生长、发育、分化是维持大脑功能的基础;而在机体衰老过程中,神经细胞的凋亡会日益增加,导致线粒体功能紊乱。因此,加强对RSV的脑神经细胞保护作用研究具有重要意义。来自南昌大学食品科学与技术国家重点实验室的张贤益、宋也好、李露和李文娟*等人利用D-半乳糖(D-gal)建立小鼠衰老模型,检测RSV对小鼠体质量、脑器官指数、脑记忆水平、神经细胞凋亡、ROS水平、MMP变化、线粒体Caspase-9和Caspase-3活力、线粒体Cyt c和胞浆Cyt c表达情况的影响,探究RSV是否通过线粒体机制对衰老小鼠脑神经细胞产生保护作用。
1、RSV对小鼠体质量的影响
各组小鼠在实验初期的平均体质量基本相同,组间无显着差异(P>0.05),在第7周进行RSV灌胃后,由于灌胃操作可能会对胃肠黏膜造成损害,导致小鼠食欲低下,体质量短时间内小幅下降,适应本操作后小鼠体质量又有所增长,说明RSV的剂量在本实验周期内未对小鼠体质量造成影响,不影响实验小鼠的正常生长发育。
2、RSV对小鼠脑器官指数的影响
与Control组相比,D-gal组小鼠脑器官指数明显减小,且具有显着性差异(P<0.05),表明D-gal对小鼠脑组织造成明显损伤。而与D-gal组相比,RSV处理组脑器官指数均有不同程度的提高,其中D-gal+RSV(25)组效果最为明显,与D-gal组具有显着性差异(P<0.05)。此结果表明RSV能提高D-gal致衰老小鼠的脑器官指数,对脑组织具有保护作用。
3、RSV对小鼠记忆水平的影响
与Control组相比,D-gal组小鼠穿越隐藏平台的次数明显减少,表明D-gal能使小鼠记忆水平降低,损伤记忆功能;与D-gal组相比,RSV处理组小鼠穿越隐藏平台次数均有所提高,但无显着差异(P>0.05),结果表明RSV在一定程度上能提高D-gal致衰老小鼠的记忆水平,改善记忆功能。
4、RSV对脑神经细胞调亡的影响
与Control组相比,D-gal组小鼠脑神经细胞凋亡率由3.66%增加至37.99%,存在极显着差异(P<0.01),说明D-gal引起脑神经细胞凋亡明显,所造衰老模型成功。而与D-gal组相比,RSV处理组小鼠脑神经细胞凋亡率分别降至28.32%、21.38%、18.56%,均有极显着差异(P<0.01),且抑制效果与RSV剂量呈正相关,表明RSV对D-gal致衰老小鼠脑神经细胞凋亡具有抑制作用。
5、RSV对脑神经细胞ROS水平的影响
与Control组相比,D-gal组DCF荧光强度由105.64±5.20增加至155.88±13.77,差异极显着(P<0.01),说明D-gal组小鼠脑神经细胞ROS积累明显;而与D-gal组相比,D-gal+RSV(6.25)、D-gal+RSV(12.5)、D-gal+RSV(25)组DCF荧光强度分别减至121.48±9.35、92.56±8.71、87.67±15.43,均有极显着差异性(P<0.01),且其DCF荧光强度与RSV呈剂量依赖性相关,表明RSV能够有效抑制D-gal致衰老小鼠脑神经细胞中ROS的积累。
6、RSV对脑神经细胞MMP的影响
Control组Rho123荧光强度最强,而D-gal组Rho123荧光强度最弱,两者之间具有极显着性差异(P<0.01),结果显示D-gal能使小鼠脑神经细胞MMP极显着降低,造成线粒体损伤。而与D-gal组相比,D-gal+RSV(6.25)、D-gal+RSV(12.5)、D-gal+RSV(25)组Rho123荧光强度均有极显着增强(P<0.01),且MMP的增强效果与RSV剂量呈正相关。此结果说明RSV可促进D-gal致衰老小鼠脑神经细胞MMP增强,对线粒体具有保护作用。
7、RSV对脑神经细胞线粒体凋亡途径的影响
与Control组相比,D-gal组线粒体Cyt c表达下降,胞浆Cyt c表达增强;而与D-gal组相比,RSV处理组线粒体Cyt c表达均增强,胞浆Cyt c表达均降低;表明RSV可显着促进D-gal致衰老小鼠脑神经细胞中线粒体Cyt c的表达,抑制胞浆Cyt c的表达。
另一方面,与Control组相比,D-gal组线粒体中Caspase-9和Caspase-3活力极显着上升(P<0.01);表明D-gal组Caspase家族蛋白酶已被活化。而与D-gal组相比,RSV处理组中Caspase-9和Caspase-3活力均极显着降低(P<0.01),且与RSV剂量呈正相关。说明RSV可有效抑制脑神经细胞中Caspase-9和Caspase-3活化,对线粒体产生保护作用,从而有效抑制D-gal致衰老小鼠脑神经细胞凋亡。
综上可知,对D-gal致衰老小鼠灌胃RSV 4 周后,RSV能抑制D-gal引起的线粒体凋亡通路相关参数Cyt c表达和Caspase-3、Caspase-9活力的变化,表明RSV通过线粒体通路来抑制D-gal致衰老小鼠脑神经细胞的凋亡。
结 论
实验周期内各组间小鼠体质量均无显着变化(P>0.05);而与对照组相比,D-gal组小鼠脑器官指数显着减小(P<0.05),穿越隐藏平台次数减少,脑神经细胞凋亡率极显着升高(P<0.01),表明D-gal对小鼠脑神经细胞造成明显损伤。与D-gal组相比,RSV处理组小鼠脑器官指数均上升,其中D-gal+RSV(25)组效果最明显(P<0.05);穿越隐藏平台次数均有增加,但无显着性差异(P>0.05);神经细胞凋亡率均极显着降低(P<0.01),表明RSV对D-gal致衰老小鼠脑神经细胞具有保护作用。与Control组相比,D-gal组小鼠脑神经细胞ROS水平极显着升高(P<0.01),MMP极显着降低(P<0.01),Caspase-9和Caspase-3活力极显着上升(P<0.01),线粒体Cyt c表达下降、胞浆Cyt c表达增加,表明D-gal对小鼠线粒体功能造成损伤;而与D-gal组相比,RSV处理组小鼠脑神经细胞ROS水平均极显着下降(P<0.01),MMP均极显着升高(P<0.01),Caspase-9和Caspase-3活力均极显着降低(P<0.01),线粒体Cyt c表达显着上升(P<0.05),胞浆Cyt c表达显着降低(P<0.05)。结论:RSV能通过线粒体通路对D-gal致衰老小鼠脑神经细胞产生保护作用。