海南大学食品科学与工程学院的梁丛颖、周 偏、李从发*等人针对诺丽自然发酵汁中的醋酸菌进行筛选、分离纯化，并利用生理生化实验进行初步鉴定，16S rRNA同源序列分析，对比所获得的醋酸菌与工业菌株AS1.41的发酵特性，为醋酸菌的筛选提供较好的参考，以期得到性能优良的醋酸菌菌株，在丰富优质醋酸菌库的同时，为诺丽发酵汁品质的提高以及诺丽新产品开发等提供支持。
1、醋酸菌的分离纯化
以诺丽自然发酵汁为样本，按照上文方法进行菌株富集培养和分离纯化，共得到67 株供试菌株。通过革兰氏染色镜检结果排除21 株革兰氏阳性菌株。从剩下的46 株菌种中挑选24 株进行生理生化试验，结果表明该24 株菌种均为过氧化氢酶阳性，且醋酸菌定性实验均有红褐色沉淀，为醋酸菌疑似菌株。
2、16S rRNA的鉴定
菌株DNA的提取及PCR扩增结果
所有醋酸菌疑似菌株16S rRNA的PCR扩增产物的片段大小均在1 500 bp左右，且扩增条带非常清晰明亮可见，无明显非特异性扩增，故该PCR产物可满足后续实验要求。
16S rRNA 序列同源分析鉴定
从诺丽发酵汁中共鉴定出醋酸杆菌属（Acetobacter）和葡糖杆菌属（Gluconobacter）两大类，包括可可豆醋酸杆菌A. fabarum（9 株）、蒲桃醋酸杆菌A. syzygii （7 株）、巴氏醋酸杆菌A. pasteurianus（2 株）、热带醋酸杆菌A. tropicalis（1 株）、兰比可醋酸杆菌A. lambici（1 株）、日本葡糖杆菌G. japonicus（4 株）6 个种，可见诺丽发酵汁中醋酸菌的丰富多样性。
系统发育树的构建
代表菌株在系统发育树中基本分为6 个分支：N21与A. tropicalis A77和A. tropicalis Y-1BM处于同一分支；N11与G. japonicus NBRC3271和G. japonicus HD1025为一个分支；N4与A. pasteurianus NBRC3248处于同一分支；N17与A. fabarum G2-5为一个分支；N10与A. lambici LMG27439为一个分支；N5与A. syzygii NBRC16604和A. syzygii 9H-2为一个分支。
3、醋酸菌的发酵特性
菌株的生长曲线
7 株醋酸菌的生长曲线相似，N4、N10和N11对数期为6～48 h，其他菌株的对数生长期均在6～66 h。其中，N10生长速率最快，在12 h时OD600 nm值达到0.810，N21和参照菌株AS1.41生长速率次之且生长量最高，其次是N5、N17、N11和N4，说明菌株N10和N21相比于其他菌株更加适应该条件。
菌株的耐高温性能
7 株醋酸菌在28～40 ℃的温度范围内均能生长，且生长量和产酸量随着温度的上升呈现先增加后下降的趋势。N11、N17分别在28、31 ℃时生长量和产酸量最高，而N4、N5和AS1.41的最适生长温度为34 ℃。当培养温度在28～34 ℃范围时，N4、N5、N10、N17、N21和AS1.41的生长量和产酸量变化较小，而菌株N11相对敏感。
菌株的耐乙醇性能
随着初始乙醇体积分数的增加，各菌株生长量基本呈下降趋势，产酸量均呈先增加后减小趋势；各醋酸菌基本上在乙醇体积分数为1%时生长量最大，乙醇体积分数为3%产酸量最高，表明低体积分数乙醇会限制醋酸菌的产酸量。当乙醇体积分数增加到7%时，菌株N4和N5基本停止生长，N11、N17、N21和AS1.41的生长有所抑制，但OD600 nm值均能达到0.650以上，且只有N21和参照菌株AS1.41能维持较高的产酸效率，产酸量达到23.60 g/L，略高于参照菌株AS1.41（22.77 g/L）。
结 论
本实验全面研究了诺丽自然发酵过程中醋酸菌的多样性及分布，不仅丰富了诺丽中醋酸菌种属信息，同时为诺丽发酵汁传统工艺的改善及诺丽发酵产品的开发利用提供一定理论基础。但由于在诺丽发酵汁中关于醋酸菌的研究尚少，其在诺丽发酵过程中的作用和功能以及在诺丽发酵汁中的功效性成分的产生方面是否发挥一定的作用，还有待于进一步研究。
