因此，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心、北京市食品添加剂工程技术研究中心的罗天淇、郭婷和杨贞耐*等人分离纯化藏灵菇发酵产生的EPS，采用红外光谱、气相色谱-质谱（GC-MS）联用、扫描电镜、原子力显微镜等研究其结构特性，并将此EPS应用于切达干酪中，进一步研究其对发酵过程以及干酪品质的影响，以期为深入研究藏灵菇EPS在发酵乳制品中的应用提供参考。
1.藏灵菇EPS产量测定
综合藏灵菇发酵乳的凝乳时间、黏度及拉丝长度，对比从30 种藏灵菇样品中筛选出的7 个较优样品的EPS产量，确定藏灵菇KW1具有最高的EPS产量，为624.82 mg/L，与其他组有显着差异（P＜0.05）。在相似培养、检测条件下，与其他类似研究报道的EPS产量相比，也处于较高水平。
2.EPS的分离纯化
藏灵菇KW1发酵培养物经除蛋白处理、醇沉、透析和冷冻干燥后得到的粗多糖，在阴离子交换色谱层析中被0.2 mol/L NaCl盐溶液洗脱下来，表明此EPS是酸性多糖或者带有酸性基团。通过SepharoseCL-6B凝胶色谱柱进一步纯化，不同大小的分子被洗脱分开，产生单一洗脱峰，获得纯化EPS并用于后续理化分析。
3.EPS官能团的红外光谱分析
根据藏灵菇KW1 EPS的红外光谱分析结果，在3 420 cm-1附近的峰主要是由羟基的伸缩振动引起的峰，可能是来源于样品吸附的水分、样品分子内的羟基或分子间氢键的拉伸峰；在2 925 cm-1附近的峰主要是由甲基或亚甲基的C—H键的伸缩振动引起的峰；在1 645 cm-1附近的峰主要是由羰基的伸缩振动引起的峰，这个峰是多糖的特征吸收峰；1 563 cm-1和1 384 cm-1处的峰是羧基中C＝O的对称伸缩振动峰；1 231 cm-1和1 076 cm-1处的峰是C—O键的伸缩振动峰，其来源可能为C—O—H，或是糖环中的C—O—C，也有可能为缩醛键；874 cm-1说明可能存在α-糖苷键。
4.EPS单糖组成分析
对藏灵菇KW1提取纯化后的EPS进行水解和乙酰化后，得到相应的衍生物，并通过气相色谱测得藏灵菇KW1产EPS的气相色谱图，与标准单糖色谱图对比后可知，藏灵菇KW1 EPS由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，相对物质的量比为1∶3.02∶2.12∶1.59∶3.04，与红外光谱结果一致。EPS的单糖组成受到菌株类型、培养条件等因素的影响，藏灵菇KW1在其他培养条件下可能能够产生不同组成的EPS。
5.EPS扫描电镜和原子力显微镜分析
藏灵菇KW1 EPS的扫描电镜观察如图6所示，EPS显示出相对稳定的三维微观结构（下图A），EPS表面粗糙呈颗粒状，整体上呈致密的网状结构，内部分布着许多大小形状相似的球形结构和不规则片状结构。进一步放大倍数可以看出（下图B），EPS表面结构紧致光滑，这种较为稳定的结构，可以赋予EPS特殊的流变学性质，例如提升产品的黏度、改善质构和保水特性。
平面图像（下图A）显示，EPS分布不均匀，在某些区域EPS结构紧密呈膜状，这说明EPS发生了聚集，在多糖质量浓度大的区域，羟基数目多，分子间的氢键缔合作用增强，多糖聚合较紧密，形成膜状结构。在立体图像（下图B）中，可以观察到EPS表现出高低不平、分布不均的状态，平面图像中的膜状区域呈现出紧密的簇状结构，而在其他区域可以看到多糖分子形貌如尖锥状结构，高度在2.4 nm左右。
6.EPS对发酵剂的影响
在两组液体培养基中，发酵剂菌株在调整期都生长缓慢，曲线较接近，3～4 h之后均进入对数生长期，菌株生长速度加快，但实验组菌株的生长情况明显要优于对照组，并且进入稳定期后，实验组发酵液OD值显着高于对照组（P＜0.05）。EPS的添加量对发酵剂产酸有着显着影响。随着EPS添加量的提高，发酵乳产酸呈现先升后降的趋势；在添加量为1%时，pH值降至约4.5，产酸达到最大值。
7.EPS对切达干酪品质的影响
01
EPS对干酪得率、保水率的影响
空白组干酪的得率、保水率与实验组干酪有显着差异（P＜0.05），而菊粉组和EPS组得率、保水率无显着差异（P＞0.05），均能有效提高干酪得率，增加干酪保水率，这可能与菊粉和EPS能够一定程度上改善干酪内部三维结构稳定性有关。
02
EPS对干酪理化指标和微生物指标的影响
在干酪成熟的过程中，干酪含水量随着成熟时间的延长而下降，下降速度逐渐减慢；添加有菊粉、EPS的实验组干酪含水量显着高于空白组（P＜0.05）。而成熟期间各组干酪的pH值逐步降低，之后趋于稳定，菊粉的加入对干酪pH值的影响比较明显，而空白组与EPS组干酪pH值无显着差异（P＞0.05），说明EPS的加入不会使干酪品质发生明显偏差。观察干酪成熟期间活菌数的变化，成熟过程前6 周干酪中的微生物含量在不断增加，之后趋于稳定。菊粉组和EPS组的微生物含量与空白组比较有显着差异（P＜0.05）。
03
EPS对切达干酪风味的影响
1. EPS干酪挥发性风味物质的GC-MS结果分析
采用SPME-GC-MS，从成熟12 周的EPS干酪中共鉴定出69 种挥发性风味物质，包括烃类14 种，醇类14 种，醛类4 种，酮类7 种，酸类8 种，酯类21 种，其他化合物1 种。其中含量最高的为酯类化合物，含量为5 042.44 μg/kg，其次为醇类、酮类、烃类、酸类、醛类以及其他化合物。
2. EPS干酪风味活性物质的OAV分析
采用气相色谱-质谱联用从干酪中检测出69 种挥发性物质，香气活性值显示共有17 种风味物质对EPS干酪整体风味有贡献，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯是关键性风味物质。在本实验中，酯类物质含量最高，同时对EPS干酪风味贡献最大。
结 论
本研究对藏灵菇发酵产EPS进行了分离纯化，确定该EPS由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，物质的量比1∶3.02∶2.12∶1.59∶3.04，在红外光谱下显示出典型的多糖吸收峰模式。扫描电镜结果表明，该EPS微观结构中分布着许多表面比较光滑的球状、片状结构；原子力显微观察，EPS呈现一定的聚集现象，具有膜状、簇状结构。藏灵菇EPS对发酵剂菌株的生长有促进作用，这种作用随着添加量的增加先增后减。同时还能够提高切达干酪得率、含水量、保水性以及成熟期间的活菌数。SPME-GC-MS分析结合OAV法表明，在69 种挥发性物质中，有17 种风味物质对EPS干酪整体风味有贡献，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯是关键性风味物质。本研究将为藏灵菇EPS在乳酸菌发酵及干酪加工中的应用提供重要的技术参考。
