浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江食品质量安全工程研究院的傅玲琳、黄健健、王彦波*等人利用同源重组，将MBP、CTB以及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）重组为融合蛋白MBP-CTB-EGFP，荧光探究MBP-CTB-EGFP能否跨越细胞膜，从而具有作为黏膜佐剂的潜力。此外用水产品中主要过敏原原肌球蛋白（tropomyosin，TM）构建MBP-CTB-TM，并将其从大肠杆菌原核表达获得的融合蛋白应用于动物致敏实验，探究融合蛋白的致敏性及其对小鼠食物过敏相关免疫反应的影响，探索其是否能降低过敏原使用剂量，从而替代天然蛋白进行TM相关的食物过敏研究。
1、pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His质粒构建
目的基因CTB片段克隆成功，条带单一整齐，无杂条带，效果较好。菌落PCR克隆成功，条带位置单一，无杂条带，位置在1 000～1 500 bp，靠近1 000 bp，与ctxB-egfp（约1 100 bp）的大小符合，表明pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His成功构建。
2、pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His质粒构建
利用同源重组，将MBP、CTB以及水产品中主要过敏原TM重组为融合蛋白MBP-CTB-TM，并进行大肠杆菌原核表达获得大量目的蛋白以为后续动物模型构建奠定基础。目的基因ctxB片段成功克隆，条带单一整齐，无杂条带，效果较好。ctxB-tm片段菌落PCR克隆成功，条带位置单一，无杂条带，位置在1 000～1 500 bp，也与ctxB-tm（约1 200 bp）的大小符合。
3、重组蛋白MBP-CTB-EGFP及MBP-CTB-TM表达及纯化
Ni-NTA纯化后MBP-CTB-EGFP融合蛋白纯度较高，杂蛋白较少，SDS-PAGE图只在上样量非常大时才显示有杂条带。由Western bolt和SDS-PAGE结果可知，MBP-CTB-TM融合蛋白可在E. coliBL21中大量表达，且Ni-NTA纯化后可得高浓度且纯度较高的融合蛋白MBP-CTB-TM。经过蛋白含量测定，MBP-CTB-EGFP和MBP-CTB-TM在大肠杆菌的表达量在50～80 mg/L培养液。
4、MBP-CTB-EGFP重组蛋白细胞膜穿透能力验证
MBP-CTB-EGFP融合蛋白确实可穿过HEK293T细胞的细胞膜进入到细胞内，说明MBP-CTB-EGFP在原核表达后仍具有作为黏膜佐剂的能力，从而促进外源蛋白进入细胞内。此外，通过与MBP-CTB-EGFP基因利用转染进入细胞相比，MBP-CTB-EGFP融合蛋白携带外源蛋白进入细胞的效率更高。
5、融合蛋白MBP-CTB-TM对小鼠血清中TM特异性抗体的影响
融合蛋白MBP-CTB-TM免疫小鼠后，血清中均能检测到高水平的TM特异性IgE、IgG1、IgG2a，初步表明融合蛋白MBP-CTB-TM确实可替代蛋白使小鼠产生TM特异性的抗体反应。
6、融合蛋白MBP-CTB-TM对小鼠脾脏细胞培养上清中细胞因子质量浓度的影响
MBP-CTB-TM组中小鼠脾脏细胞培养上清中Th2型细胞因子IL-4、IL-5并没有显着上升且都低于TM组，而Th17型细胞因子IL-6、IL-17A显着上升且都高于TM组，且IL-17A的质量浓度比TM组显着增加，说明融合蛋白MBP-CTB-TM比天然蛋白TM更易于促进Th17型反应的发生。
结 论
本研究将MBP-CTB-EGFP、MBP-CTB-TM两个重组蛋白在E. coli BL21中表达，重组蛋白表达量高，易于提取，不受季节影响，为后续采用重组蛋白构建食物过敏动物模型的研究提供了实验材料，有望减少抗原的使用量，缩短口服致敏模型构建及机理研究的前期准备时间。然而值得注意的是，原核重组表达的融合蛋白与多数真核过敏原相比，其致敏机理可能存在差异，故重组蛋白是否具有黏膜佐剂和过敏蛋白的作用，并产生1＋1＞2的效果仍是未知，需进一步验证。
