前期研究发现植物甾醇酯(PSE)可显着减轻NAFLD大鼠肝脏的脂肪变性程度,并且其可通过调节PPAR-α、PPAR-γ等脂代谢相关基因发挥预防NAFLD的作用,但具体机制不明。为进一步探究PSE干预对NAFLD预防作用的代谢分子机制,上海交通大学农业与生物学院的欧阳鹏凌、管 玘、宋立华*等人在前期研究基础上利用UPLC联用四极杆串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术检测NAFLD大鼠血清中小分子代谢物的变化,从代谢组学的角度进一步阐明PSE发挥NAFLD预防作用的机制。
1、血清小分子代谢物检测不同前处理方法比较
为了使样品浓度较小时不易污染离子源,从而增加仪器的耐受性,并使蛋白质沉淀完全,在50?μL血清中加入200?μL甲醇-乙腈(1∶1)进行前处理。
2、PSE干预对NAFLD大鼠血清中小分子代谢物的影响
多维统计分析结果
利用SIMCA-P软件对各组大鼠血清小分子代谢物进行无监督的数据分析(PCA)后,可得到模型概括X矩阵解释率(R2X),当R2X>0.4时说明该模型可靠。本实验样品在正离子模式下R2X=0.78,负离子模式下R2X=0.74,因此所建立的模型可以很好地解释各组间差异。
差异代谢物的确认
大鼠适应性喂养一周后随机分为以下4 组:正常对照组(NC,n=4)、高脂模型组(HF,n=9)、低剂量PSE组(PSE-L,n=9)和高剂量PSE组(PSE-H,n=9)。NC组大鼠饲喂基础饲料,其余各组饲喂高脂饲料。NC和HF组灌胃给予普通纯牛奶(1 mL/100 g mbgd),PSE-L和PSE-H组分别灌胃给予与NC组同体积的低(0.05 g/100 g mbgd)、高剂量(0.10 g/100 g mbgd)PSE强化牛奶(相当于成人3 g/d和6 g/d的摄入量),连续灌胃12 周。
与NC组相比,HF组27 种差异代谢物的离子强度均有显着性差异(P <0.05 )。与HF组相比,PSE-H组甘油二酯(15∶0/18∶3(6Z,9Z,12Z)/0∶0、14∶0 / 2 2∶2(13 Z ,16 Z ) / 0∶0 )、溶血卵磷脂(18∶2(9Z,12Z)、15∶0、16∶1(9Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)、18∶1(9Z))、磷脂酰胆碱(16∶0/P-18∶0、17∶1(10Z)/0∶0)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、18∶1(11Z )/ 20∶1(11Z )、O -18∶0 / 0∶0)、磷脂酸(22∶4(7Z ,10 Z ,13Z ,16Z )/ 0∶0)、磷脂酰乙醇胺(16∶0 / 0∶0、2 0∶3(8Z ,11Z ,14Z )/ 0∶0)、磷脂酰肌醇(20∶0 / 22∶2(13Z ,16Z ))的离子强度降低,鞘磷脂(d18∶1/24∶0 、d16∶1 /25∶0 )、鞘糖脂(d18∶1/1 8∶1(9Z ))、神经酰胺(d18∶2 / 2 0∶0)的离子强度升高;PSE-L 组甘油二酯(16∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0)、二十一烷二酸和磷脂酰乙醇胺(18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0)离子强度下降,甘油二酯(18∶1(11Z)/18∶1(11Z)/0∶0)、磷脂酰胆碱(16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z))、磷脂酰乙醇胺(18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))离子强度显着下降。
代谢通路分析
选择影响值大于0.10的代谢通路作为潜在的靶向途径,得到由磷脂酰胆碱(16∶0/P-18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z))、磷脂酰乙醇胺(18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)、18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0)以及溶血卵磷脂(15∶0、16∶1(9Z)、18∶1(9Z)、18∶2(9Z,12Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z))参与的甘油磷脂代谢通路和磷脂酰胆碱(O-18∶0/0∶0)参与的醚脂质代谢通路。
结 论
本实验通过UPLC-Q-TOF-MS技术检测PSE干预后NAFLD大鼠血清中小分子代谢物的变化,筛选出27 种差异代谢物,包括甘油二酯、神经酰胺、鞘糖脂、溶血卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂以及脂肪酸,涉及的代谢通路为甘油磷脂代谢和醚脂质代谢通路。研究结果表明,PSE干预可降低血清中甘油二酯、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、二十一烷二酸的离子强度,升高鞘磷脂、神经酰胺、鞘糖脂的离子强度,说明PSE可以通过对甘油磷脂以及醚脂质代谢通路进行调节以纠正脂类代谢紊乱,减轻高脂饮食造成的脂质积累,影响NAFLD的发生发展。