作为首个被分离并获得结晶的铁蛋白，马脾铁蛋白备受关注，其在医药新材料、免疫电子显微镜分析技术、疾病诊断等多领域都有广泛应用。马脾铁蛋白单独作纳米颗粒载体时，往往存在稳定性差、体系易受环境因素影响的缺陷。海藻酸钠（SA）作为天然高分子聚合物，具有生物相容性良好、可在体内降解、毒性低、来源广泛、价格便宜的优势，因此受到越来越多地关注。已有研究表明将此两种物质结合运用，既可发挥铁蛋白可逆组装特性又兼具多糖的控释效果。
浙江海洋大学食品与医药学院的夏伟荣、方旭波*和江苏省农业科学院农产品加工研究所的李莹*等人以马脾脱铁铁蛋白（HSF）及海藻酸钠（SA）为载体材料包埋ACE抑制肽AHLL，利用铁蛋白和多糖的相互作用，制备均匀分散的HSF-ACE抑制肽（HSFAHLL）及HSF-SA-ACE抑制肽（HSF-SA-AHLL）纳米复合体系，以期提高AHLL在消化系统中的吸收效果。
1 AHLL质量浓度对纳米粒包埋效果的影响
在HSF浓度为2 μmol/L条件下，装载不同终质量浓度的AHLL溶液，制备过程中其他条件不变，研究AHLL质量浓度对其包封率的影响。结果显示，随着AHLL质量浓度的增大，纳米粒的包封率先显着增大，之后出现平缓趋势，又显着减小。考虑到包埋浓度过低会造成AHLL在胃肠道中吸收作用不明显，以及Caco-2细胞实验中AHLL的存活率，综合比较，选择AHLL终质量浓度范围在100～200 μg/mL之间。
2 HSF浓度对纳米粒包埋效果的影响
改变包埋体系中载体HSF浓度，相同实验条件下，体系中AHLL终质量浓度为150 μg/mL，研究载体蛋白浓度对AHLL纳米粒包封率的影响。结果显示，随着HSF浓度的增大，纳米粒的包封率先显着增大至一定数值后趋于平缓，之后又出现显着下降的趋势，可见纳米粒的包封率并不与载体蛋白浓度呈正相关关系。因此，选择载体蛋白浓度在1～2 μmol/L范围内制备纳米粒。
3 SA质量浓度对纳米粒包埋效果的影响
在HSF浓度2 μmol/L、载入AHLL终质量浓度150 μg/mL、其他条件相同的条件下制备HSF-AHLL纳米粒。调体系pH值为3.0，加入一系列不同质量浓度的SA溶液，研究多糖质量浓度对纳米粒包封率的影响。结果显示，包封率开始显着升高，直到多糖质量浓度为10 mg/L后趋于平衡。SA质量浓度为10 mg/L就可以使复合纳米粒包封率达到最高。
4 粒径和电位分析
结果显示，空壳的HSF粒径为19.62 nm，粒径分布均匀。载入ACE抑制肽后，HSF-AHLL纳米粒粒径增大至28.19 nm，比空壳的HSF粒径约大9 nm。由此，从粒径大小证明了纳米包埋体系是存在的，AHLL有可能被包埋在纳米粒中。纳米粒作为一种活性物质的传输载体，其Zeta电位是考察体系的重要因素之一。Zeta电位测定结果显示HSF-AHLL和HSF表面都带负电荷，HSF的电位为-39.9mV，HSF-AHLL的电位约-34 mV，这些电荷保证了整个包埋体系的稳定性。
为利用蛋白和多糖分子在酸性条件下的静电吸引作用形成结构紧密的络合物，本实验选择在pH 3.0的条件下制备HSF-SA-AHLL复合纳米粒。图4为SA质量浓度对复合纳米颗粒Zeta电位和粒径的影响。结果显示，随着SA质量浓度的增加，体系的Zeta电位值不断降低，而粒径值逐渐增加，至铁蛋白表面电荷被完全中和，体系电荷呈中性状态，再进一步增大SA添加量，体系电位变成负值，聚合物解聚过程占主导地位，粒径也逐渐变小。
由于随着SA质量浓度的增加，体系中负电荷量逐渐增大，蛋白表面也完全被过量的SA分子占据，大量多糖的亲水链朝向水相，同时静电斥力和空间位阻效应阻止了体系中颗粒进一步的相互靠近、接触和聚集，导致溶液中粒径较小的颗粒占主导，均匀分布在其中，使得体系更加稳定。本实验研究表明，SA质量浓度高于10 mg/L后，体系的Zeta电位和粒径均处于平台期，不再随其质量浓度的变化而变化，制备的HSF-SA-AHLL复合纳米粒体系更稳定。
5 透射电子显微镜分析
如图5所示，空壳HSF为均一的球形，蛋白中心有少许黑点，这可能是马脾蛋白脱铁时残留的Fe元素。由图5B可以看出，纳米粒HSF-AHLL也是球形，铁蛋白空壳中有一颗颗小分子物质被包裹其中，ACE抑制肽AHLL在铁蛋白亚基重组过程中被包埋进去，说明此包埋纳米粒体系是存在的。图5C显示：SA没有出现明显的多糖聚集状态。而且，HSF-SA-AHLL复合纳米粒也有与HSF-AHLL纳米粒相似的球形形态，只是直径较前者大。
透射电子显微镜结果表明HSF的粒径约20 nm，HSFAHLL纳米粒的粒径为30 nm，HSF-SA-AHLL复合纳米粒的粒径约为150 nm，与Malvern Nano ZS90纳米粒径仪测定的粒径值基本一致，表观证明了HSF-AHLL和HSF-SAAHLL形成了稳定的纳米体系。
6 不同处理的AHLL在Caco-2细胞单层模型上吸收效果
AHLL、AHLL和HSF混合物以及HSFAHLL包埋纳米粒在Caco-2细胞单层模型上的吸收量在AP→BL和BL→AP两个方向随时间的变化情况显示，随着时间的延长，不同处理的AHLL在两个方向的转运量都呈现不断升高的趋势，反映了AHLL的双向转运对时间的依懒性。而其在Caco-2细胞单层的渗透在90 min以内呈线性增长，在150 min时呈饱和状态，表明主动运输和被动转运同时存在。在AP→BL和BL→AP两个方向，其表观渗透系数均大于10-6 cm/s，表明AHLL在人体肠道中的吸收较好。
对于AP→BL方向的转运，同一时间内，HSF-AHLL包埋纳米粒明显比单独的AHLL及HSF和AHLL混合物在Caco-2细胞单层模型上转运量大，且表观渗透系数（第90分钟）也明显高于后两者。对于BL→AP方向的转运，结果显示，HSF和AHLL混合物以及HSF-AHLL纳米粒相比单独的AHLL，其表观渗透系数没有显着差异（P＞0.05），如何减小外排作用还需进一步研究。
结 论
本实验利用铁蛋白在强酸条件下可逆组装性质和多糖的控释作用，通过HSF和SA静电吸引形成良好的复合包埋载体。将ACE抑制肽AHLL装载到铁蛋白的空腔内，以期研究得到的高活性HSF-AHLL及HSF-SA-AHLL纳米粒，其形态呈球形。研究表明制备纳米粒的最优条件为载体HSF浓度1～2 μmol/L、多糖质量浓度10 mg/L、AHLL终质量浓度100～200 μg/mL，可制备出包封率较高的纳米粒体系。通过粒径和电位测定分析，相比游离的ACE抑制肽AHLL，装载在HSF空腔中形成的纳米粒体系更加稳定。
同时，通过HSF-AHLL在Caco-2细胞单层模型中的体外转运实验，其比游离AHLL在小肠中吸收效果更好。因此，铁蛋白和SA作为一种双壁材纳米载体，可成功用于包埋ACE抑制肽AHLL，且HSF-AHLL纳米粒有效提高了ACE抑制肽AHLL在消化系统中的吸收效果。本实验可对食品加工中小分子活性营养物质的稳定性保持和高效吸收提供一定的参考依据。
