本方法规定了食品中罗丹明B的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于辣椒粉和辣椒酱中罗丹明B的快速测定。
2 原理
本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的罗丹明B经有机试剂提取,固相萃取小柱净化,浓缩复溶后,罗丹明B与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合,抑制了抗体和微孔膜检测线(T线)上抗原的结合,从而导致检测线颜色深浅的变化。无论样本中是否含有罗丹明B,控制线(C线)均会显色。通过检测线与控制线颜色深浅比较,对样品中罗丹明B残留进行定性判定。
3 试剂和材料
除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的二级水。
3.1 试剂
3.1.1 正己烷。
3.1.2 丙酮。
3.1.3 甲醇。
3.1.4磷酸氢二钠,Na2HPO4·2H2O。
3.1.5 磷酸二氢钠,NaH2PO4·2H2O。
3.1.6 提取试剂:将正己烷与丙酮按照体积比80:20混匀。
3.1.7 复溶液:称取35.61g磷酸氢二钠(3.1.4)置于1000ml容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,制成0.2mol/L溶液A;称取31.21g磷酸二氢钠(3.1.5)置于1000ml容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,制成0.2mol/L溶液B。将溶液A与溶液B按照体积比67:33混匀,制成pH 7.1磷酸盐缓冲液。
3.2 参考物质
罗丹明B参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子量见表1,纯度≥98.6%
表1 罗丹明B参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
注:或等同可溯源物质。
3.3标准溶液配制
3.3.1 罗丹明B标准储备液(1 mg/mL):精密称取罗丹明B参考物质(3.2)10 mg,置于10 mL 容量瓶中,用甲醇(3.1.3)溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度为1 mg/mL 的罗丹明B标准储备液。冷藏,有效期6个月。
3.3.2 罗丹明B标准中间液A(1 μg/mL):精密量取罗丹明B标准储备液(1 mg/mL)(3.3.1)0.1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用甲醇(3.1.3)稀释至刻度,摇匀,制成 1 μg/mL的罗丹明B标准中间液A。临用新制。
3.3.3罗丹明B标准中间液B(100ng/mL):精密量取罗丹明B中间液A(1μg/mL)(3.3.2)1 mL,置于10 mL 容量瓶中,用甲醇(3.1.3)稀释至刻度,摇匀,制成 100ng/mL的罗丹明B标准中间液B。临用新制。
3.4材料
3.4.1固相萃取小柱:中性氧化铝柱,1000mg/6ml。
3.4.2免疫胶体金试剂盒(在2℃~8℃、干燥、避光条件下保存,在产品有效期内使用)。
3.4.2.1 金标微孔。
3.4.2.2 试纸条或检测卡。
4 仪器和设备
4.1 移液器:200 μL、1 mL 和10 mL。
4.2 涡旋混合器。
4.3 离心机:转速≥4000 r/min。
4.4 电子天平:感量分别为 0.01 mg 和 0.01 g。
4.5 振荡器。
4.6 样品浓缩仪:如有需要。
4.7环境条件:温度:15℃~25℃,相对湿度:≤60%。
5分析步骤
5.1试样制备
取具有代表性样品约500 g,充分粉碎混匀,均分成两份,分别装入洁净容器作为试样和留样,密封,标记,于常温保存。
5.2试样提取和净化
准确称取试样2g(精确至0.01g)置于50mL具塞离心管中,依次加入20mL提取剂(3.1.6),振荡提取3min,以5000r/min 离心5min。上清液待净化。
吸取5mL提取剂(3.1.6)于固相萃取小柱中,流出液弃去。将上清液全部转移至固相萃取小柱中,流出液弃去。再加入20mL提取剂(3.1.6)淋洗固相萃取小柱,流出液弃去。用5mL甲醇洗脱小柱,收集洗脱液吹干。精密加入500?L复溶液(3.1.7),涡旋混合1min,作为待测液。
5.3 测定步骤
5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤
吸取200?L样品待测液于反应微孔(3.4.2.1)中,抽吸 5~10 次使混合均匀,室温温育 5 min;温育结束后,将检测试纸条(3.4.2.2)吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中,室温温育 5~8 min,从微孔中取出试纸条,去掉试纸条下端的吸水海绵,进行结果判定。
5.3.2 检测卡与金标微孔测定步骤
吸取全部样品待测液于反应微孔(3.4.2.1)中,抽吸 5~10 次使混合均匀,室温温育 5 min;温育结束后,将金标微孔中溶液滴加到检测卡(3.4.2.2)上的加样孔中,室温温育 5~8 min,对结果进行判定。
5.4质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
5.4.1 空白试验
称取空白试样,按照 5.2和5.3 步骤与样品同法操作。
5.4.2 加标质控试验
准确称取空白样品 2 g 或适量(精确至0.01g)置于 50 mL 具塞离心管中,加入 100 μL 或适量罗丹明B标准中间液 B(100 ng/mL)(3.3.3),使罗丹明B浓度为 5 μg/kg,一式2份,按照 5.2和5.3 步骤与样品同法操作。
6 结果判定要求
通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化,需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。
6.1 无效
控制线(C线)不显色,表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
6.2 阳性结果
检测线(T线)不显色或检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色浅,表明样品中罗丹明B含量高于方法检测限,判定为阳性。
6.3 阴性结果
检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色深或者检测线(T线)颜色与控制线(C线)颜色相当,表明样品中罗丹明B含量低于方法检测限,判定为阴性。
6.4质量控制要求
空白试验测定结果应为阴性,加标质控试验测定结果应为阳性。
7 结论
如被测样品中罗丹明B检测结果为阳性时,应采用确证方法进行确证检测。
8 性能指标
8.1 检测限:罗丹明B为5 μg/kg。
8.2 灵敏度:灵敏度应≥99%。
8.3 特异性:特异性应≥85%。
8.4 假阴性率:假阴性率应≤1%。
8.5 假阳性率:假阳性率应≤15%。
注:性能指标计算方法见附录A
9其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便,在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前,须对其进行考察,应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为SN/T 2430-2010《进出口食品中罗丹明B的检测方法》(包括所有修改单)。