——不是的，这是浪费时间的一个操作。 我们首先来讨论一下蛋白定量的科学性。
蛋白定量首先需要一个参照系（标准蛋白），参照蛋白通常选择BSA，也就是说你所谓的定量是对应于BSA的浓度的一个参照值。这里面存在一个问题，即忽略了蛋白折叠和空间构象对光吸收、折射的影响；不同的蛋白折叠和构象还会影响颜料分子的嵌入。因此你其实默认将所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折叠状态、光吸收情况下，然后做出的一个相对判断，这就存在一个“系统误差”——还不算上测量误差等等，就已经很不准确了。 其次，裂解组织或细胞的时候，那些裂解液中，某些溶剂本身会使CoomassieG250或者Bradford法（实际也是Coomassie染色）显色，尤其是去污剂之类；例如NP40，就会使Coomassie显蓝色，可以完全覆盖掉蛋白与Coomassie作用产生的蓝色。因此，如果你的裂解液里面含有这类物质，所谓的蛋白定量实际是NP40颜色和蛋白染色的叠加，根本不会符合标准蛋白曲线的线性规律，自然定不准。【需要说明：我目前只知道NP40会这样，因为我们从来不去定量，没有做过更深入的研究。】
实际上保证你的内参一致，是从样品制备开始的，上节末尾有提到，不赘述。如果你从制备样品时就注意过定量问题，实际上通常内参差别不会太大。如果真的有差别，通常我们会先跑少量的样品，目的是让Actin或tubulin更清晰、不会粘连、不会过曝光。从而在第二轮跑正式结果前，根据第一轮的内参的荧光信号做微调，大致能做到相当；最多可能需要第三轮。以上的试验可以精确到0.1ul差异（我很多体外生化试验之前的调整酶量就是这样进行，此时根本不可能有足够的蛋白让你去定量）。当然凭曝光强弱调整上样量的前提是，你的WB技术很稳定，很可靠，这是需要相当多的经验积累，如果你一时掌握不了，可以让经验更丰富的师兄师姐或者导师帮忙。
顺便提到，有人问过用Quantity One等定量软件对光密度定量后计算差别从而调整上样体积是否可以？——不可以。因为WB结果经过多重放大，精确计量只代表相对于对照组的相对比值，与实际比值还是有误差，所以按计算值更改上样量仍会出现偏差。
如果非要做定量的话，要注意你的裂解液配方，把每种溶剂都先加入到显色液中尝试一下，避免那些本身会显色的物质出现在你的裂解液中；当然，某些物质的去除可能影响对组织蛋白的提取。所以这是一个两难的问题。
