本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产品。
2 术语和定义
2.1大肠埃希氏菌 Escherichia coli
大肠杆菌
广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。
2.2 最可能数
基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a） 恒温培养箱：36℃±1℃；
b） 冰箱：2℃~5℃；
c） 恒温水浴箱；44.5℃±0.2℃；
d） 天平；感量为0.1g；
e） 均质器；
f） 振荡器；
g） 无菌吸管：1mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头：
h） 无菌锥形瓶：容量500 mL；
i） 无菌培养皿：直径90mm；
j） PH计或pH比色管或精密PH试纸；
k） 菌落计数器；
l） 紫外灯：波长360mm~366mm，功率≤6W。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：
4.2 EC肉汤（E.coli broth）：
4.3 蛋白胨水：
4.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水「甲基红（MR）和V-P试验用」：
4.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基：
4.6磷酸盐缓冲液：
4.7 伊红美蓝（EMB）琼脂：
4.8 营养琼脂斜面：
4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：
4.10 结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡糖糖琼脂（VRBA-MUG）：
4.11革兰氏染色液：
4.12 Kovacs靛基质试剂：
4.13 无菌1mol/LNaOH：
4.14 无菌1mol/LHCl：
5 大肠埃希氏菌MPN计数（第一法）
5.1检验程序
大肠埃希氏菌MPN计数的检验程序见图1：
图1 大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序
5.2 操作步骤
5.2.1 样品的稀释
5.2.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10的样品匀液。，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10的样品匀液。
5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1.10的样品匀液。
5.2.1.3 样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
5.2.1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1.10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1.：100的样品匀液。
5.2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
5.2.2 初发酵实验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察小倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养48h±2h.产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。
5.2.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培24h±2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48h±2h.记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。
5.2.4 伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36℃±1℃培养18h~24h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
5.2.5 营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或者平板上，36℃±1℃，培养18h~24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。
5.2.6 鉴定
取培养物进行靛基质试验、MR-VP试验和柠檬酸盐利用试验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别见表1。
表1 大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别
5.3大肠埃希氏菌MPN计数的报告
大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为++--或者-+--。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌菌阳性。根据LST肉汤阳性管数值查MPN表，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。
6 大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）
大肠埃希氏菌平板计数法的检验程序见图2
6.2 操作步骤
6.2.1 样品的稀释
按5.2.1进行。
6.2.2 平板计数
6.2.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种1个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。
6.2.2.2 将10mL~15mL冷至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。袋琼脂凝固后，再加3mL~4mL VRBA-MUG覆盖平板表层，凝固后翻转平板，36℃±1℃培养18h~24h。
6.3 平板菌落数的选择
选择菌落数在10CFU~100CFU之间的平板，暗室中360nm~366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。
检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如ATCC13048）做阳性和阴性对照。
6.4 大肠埃希氏菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/(mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
附表：
