生物指示剂(Biological Indicators)，根据ISO11138的定义 - test system containing viable microorganisms providing a defined resistance to a specified sterilization process，即含有活的微生物的测试系统，其为特定的灭菌工艺提供确定的抵抗力。2015年版《中国药典》四部1421灭菌法的定义为“生物指示剂系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。”从定义可以看出，生物指示剂是一类含有活的微生物的测试系统，其主要用于灭菌工艺的验证或监控。
生物指示剂是用于灭菌工艺，在介绍其之前，我们需要了解灭菌的原理，以便理解生物指示剂的特性、使用和质量控制。
一、灭菌原理
所谓灭菌，即“用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去，从而使物品残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。（2015年版《中国药典》）”灭菌主要有杀灭和除去两种方式，前者是通过物理或者化学的手段杀灭产品中的微生物，后者则是通过一定的分离机制（目前主要是过滤的方式）将微生物从产品中分离。这两种方式的机理不同、动力学不同，其适合的模型也不同。本文所阐述的主要是前者，即杀灭的方式去除微生物。
当前制药工业所用的灭菌方式很多，包括热力学灭菌，如湿热灭菌，如蒸汽灭菌、过热水灭菌；干热灭菌；辐照灭菌，如γ射线灭菌、X射线灭菌、电子束灭菌；气体灭菌，如环氧乙烷灭菌、气态过氧化氢灭菌、甲醛灭菌、臭氧灭菌等。这些灭菌方式的灭菌介质不同，杀灭微生物的机理也不同，相应的工艺开发、工艺控制和工业验证也不尽相同。但是，除了辐照灭菌外，从灭菌模型的研究、灭菌工艺的验证和生物指示剂的选择和使用来看，这些灭菌方式都有共通之处。因此，本文以研究最为深入的湿热灭菌为例，详细介绍灭菌动力学和灭菌验证，从而深入了解生物指示剂在其中的作用。
湿热灭菌主要是通过高温使得微生物的蛋白质、核酸等分子发生变性，从而杀灭微生物。这个过程与很多因素有关，如灭菌温度、灭菌时间、微生物的种类和数量、微生物所处的环境、蒸汽质量等等。为研究灭菌的动力学，我们把微生物的数量（N）对灭菌时间（t）作曲线，关系如下：
这一曲线关系不利于灭菌的研究，如果把微生物的数量用对数值进行处理（lgN），再对时间（t）作曲线，则会得到以下的曲线：
这里我们可以看到，两者（微生物数量对数值lgN和灭菌时间t）成直线关系。这一转换大大方便了灭菌动力学的研究，也构成了整个湿热灭菌模型的基础。基于此模型，我们了解以下几个重要的参数：
? 微生物的耐热性，D值的概念：
自然界的微生物种类多种多样，不同微生物的耐热性是不一样的，反映在灭菌曲线（lgN~t）上，耐热性弱的微生物lgN随着时间下降较快，而耐热性强的微生物lgN随温度下降的速度慢。这一点最直接的反映便是直线的斜率（k），如果直线的斜率（绝对值，如下图）越大，微生物lgN下降越快，耐热性越低，反之亦然。
虽然斜率k值可以反应这一关系，但是为了便于理解和日常运用，我们在斜率k的基础上进行一个简单的变换，引入D值的概念。令D=?1/k=△t/△lgN，即，D值可以理解为微生物数量下降一定的对数值所需要的时间。当△lgN为1时，所需要的灭菌时间恰好等于D值，故D值定义为使微生物下降一个对数值所需要的灭菌时间。因微生物数量下降一个对数值与杀灭90%的意义相同，故D值又称之为90%杀灭时间。这样的简单转换，使得D值的定义易于理解，在灭菌工艺中也方便应用，这一点在后面的介绍中会得到体现。
D值的影响因素很多，包括（但不限于）：
生物的种类和形式，一般芽孢杆菌以芽孢的形式存在时，耐热性强，D值大；
微生物所处的形式（对于生物指示剂而言，即为生物指示剂的载体，如纸载式、不锈钢片、液体等）；
包装形式；
溶液种类（对于处于液体中的微生物而言）；
灭菌的温度。
有了D值，便可以对灭菌后的微生物数量进行计算。初始污染菌数为N0表示，灭菌后的污染菌数用NF表示，某一温度下的D值用DT表示，灭菌时间用t表示，则：
(lgN0–lgNF) = t/DT ，也即lgNF =lgN0 –t/DT
假定某一物品初始污染菌数N0 为106，某一温度T下的D值为2.5min，则：
*灭菌1分钟后，lgNF= lgN0–t/DT = 6–1/2.5 = 5.6
* 灭菌2分钟后，lgNF= lgN0–t/DT = 6–2/2.5 = 5.2
这里可以看到，随着灭菌时间t的无限增加，lgNF变得无穷小，但NF是始终大于0的，也就是说，绝对的无菌（NF为0）理论上来说是不存在的。在制药行业中，NF为10-6，也就百万分之一便是终端灭菌产品可以接受的无菌保证（概率）水平。因此，在这个案例中，如果要达到百万分之一的无菌保证水平，所需要的灭菌时间为：
-6 = 6–t/2.5， 即灭菌时间t需要30分钟。
? 微生物的耐热性（D值）与温度的关系，Z值的概念
引入D的模型只考虑了同一温度下的灭菌曲线，即灭菌过程中温度没有波动时微生物数量lgN与灭菌时间t之间的关系。事实上，产品灭菌时是无法将灭菌温度控制在某一恒定温度的。而D值，即微生物的耐热性，是与温度直接相关的，温度越高，D值越小，温度越低，D值越大。如果要研究产品的灭菌过程，我们就需要找到D值与温度的关系。
这里，我们测定同一微生物在不同灭菌温度下的D值（测试方法将在本专题的第二部分介绍），把微生物的D值的对数值lgD（纵坐标）与产品的温度T（横坐标）作曲线，会得到以下直线关系：
这里可以看出，lgD与灭菌温度T是成直线关系的（模型与lgN~t相同）。通过直线可以看出，lgD与T的负相关性与我们研究D值的来源正好相同。同样，为了便于理解和日常运用，我们也不直接用斜率k来反应这样的关系，而是引入Z值的概念；同样，令Z=?1/k=△T/△lgD，当lgD等于1时，所需要提高的温度△T恰好等于Z值。因此，Z值的定义即为Ｄ值下降一个对数值所需要提高的温度。
研究表明，大部分的微生物Ｚ值均在10 ℃左右（湿热灭菌），因此，在无特殊说明的情况下，为简化计算，Ｚ值均默认为10 ℃。
? 不同温度下灭菌时间的换算，等效灭菌时间FTref的概念
灭菌工艺虽然有温度波动，但是有了Z值的概念，我们便可以将不同温度下的等效灭菌时间通过D值进行换算。将不同温度下得灭菌时间用FTT表示，要换算120 ℃下的灭菌时间，等效于121 ℃下的灭菌时间，可根据lgN~T的关系曲线：
F121 = D121×△lgN
F120 = D120×△lgN
所谓等效灭菌时间，即灭菌效果相同所需要的灭菌时间，因此两者的△lgN相等。两等式相除，得到：
这个公式需要我们考察D值与温度的关系，这恰好是Z值的概念。根据考察Z值时D值与温度的关系，我们得到：
故，120 ℃灭菌1分钟，其相当于在121 ℃下的灭菌时间为0.79分钟。
同理，我们可以计算出灭菌过程中任何温度（T）下的灭菌时间（FT）相当于其在121 ℃下的等效灭菌时间（F121），即：
F121 = FT×10(T-121)/Z
同样，我们也可以将灭菌过程中的任何温度（T）下的灭菌时间（FT）换算为其在任何参考温度Tref下的等效灭菌时间（FTref），即：
FTref = FT×10(T-Tref)/Z
? 灭菌工艺的灭菌能力，F0值的概念
如果我们把所有的灭菌工艺都统一换算为同一温度下的灭菌时间，则不同灭菌工艺的灭菌能力便有了可比性，也可以针对灭菌能力制定量化的标准，这一参考温度便是121.1℃。如果把灭菌过程中每一时刻的灭菌时间都换算为121.1℃的灭菌时间，再进行累积，得到整个灭菌过程在121.1℃下的灭菌时间，这一时间便是F0值（ISO17665，Z值定义为10℃）。
二、灭菌工艺的灭菌能力要求
前面我们介绍过，产品的无菌保证水平（SAL）为10-6。而灭菌工艺要达到这样的SAL，所需要的灭菌能力取决于灭菌前的微生物负载（灭菌前的微生物数量）和微生物负载的耐热性。制药行业一般都有严格的微生物污染控制措施，灭菌前的微生物负载（N0）一般不会超过1066，故106便认为是微生物负载的最差条件；自然界中很少会发现D121℃大于0.5分钟的微生物，故D121℃值为1分钟，便认为微生物负载耐热性的最差条件。
过度杀灭法是将微生物负载的数量和D值同时取最差条件，即数量为106，D121℃值为1分钟，此时，要达到SAL为10-6的无菌保证水平，F0 应不低于：
F0 = D121℃×(lgN0-lgNt）= 1×(6-(-6)) = 12分钟
备注：EMA要求不低于15分钟。
此时，由于微生物负载的数量和耐热性都取最差条件，日常灭菌时，对于二者的监控不是必须的。
残存概率法中，如果微生物数量不取最差条件，耐热性取最差条件。一般情况下，微生物负载会控制在1-100的水平，故取初始数量为102；D121℃仍取最差条件，即１分钟。此时，要达到SAL为10-6的无菌保证水平，F0应不低于：
F0= D121℃×(lgN0-lgNt) = 1×(2-(-6)) = 8分钟
这也是GMP规定F0值一般不低于８分钟的原因。此时，微生物负载的数量 不是取的最差条件，日常灭菌时需要对其进行监控；而耐热性取最差条件， 故对耐热性的监控不是必须的。
当微生物负载的数量和耐热性都不取最差条件时，微生物负载的数量同上述原因仍取102，耐热性需要根据产品的的污染菌情况确定，假定经过检测，负载的D121℃最高为0.3分钟，灭菌工艺按照D121℃为0.4分钟进行设计（稍高于实际检测的最高值），则，要达到SAL为10-6的无菌保证水平，F0应不低于：
F0= D121℃×(lgN0-lgNt) = 0.4×(2-(-6)) = 3.2分钟
此时，微生物负载的数量和耐热性都不是取最差条件，日常灭菌时需要对两者同时进行监控。
三、灭菌工艺验证中的生物指示剂
根据2010年版GMP的要求，“第六十三条 任何灭菌工艺在投入使用前，必须采用物理检测手段和生物指示剂，验证其对产品或物品的适用性及所有部位达到了灭菌效果。”因此，在验证某一灭菌工艺时，不仅仅要采用物理的检测手段（对于湿热灭菌而言，主要是温度，还包括压力、蒸汽质量等），还需要采用生物指示剂进行检测，以确保灭菌工艺达到预期的灭菌效果。单纯的物理测试，一方面其检测的参数有限，不能反应所有的影响因素对于灭菌工艺的影响。常见的湿热灭菌，主要检测的参数为温度和压力，但是，蒸汽质量（过热值、干燥度、不凝气体）、产品的特性（微生物的耐热性与其所处的环境相关）等对于灭菌效果的均有影响，同时，物理检测基于前面所述的理论模型进行预测的，实际状况与理论模型不一定完全契合。因此，要验证灭菌工艺，还需要用生物指示剂进行考察，以确保物理杀灭效果（用FPHY）和生物杀灭效果（FBIO）具有一致性。这便是生物指示剂的选择基础。
四、生物指示剂的选择-物理杀灭和生物杀灭的关系
选择生物指示剂的选择的主要依据是证明FPHY和FBIO具有一致性，即物理杀灭效果能够实际杀灭相应的生物指示剂。实际操作过程时，我们通常会选择合适的生物指示剂，经过灭菌工艺灭菌后进行培养，如果全部呈阴性，那么我们判定灭菌工艺符合预定标准。
假定某一灭菌工艺，其物理杀灭效果（FPHY）为F0值不低于12分钟，理论来说，为证明一致性，所使用FBIO也应为12分钟，这样才能证明两者是一致的。假定所选择的生物指示剂的D121℃为2分钟，数量为106，则其杀灭所需要的时间理论上为：
FBIO= D121℃×(lgN0-lgN) = 12分钟
看上去，FPHY和FBIO的时间刚好相当，可选择该生物指示剂进行灭菌的验证。然而，在介绍无菌保证水平的时候我们知道，微生物存活是一个概率问题。在这个案例中，当FBIO为12分钟时，灭菌后的污染菌数量NFF为：
lgNF =lgN0–t/DT = 6–12/2 = 0，则 NF=1
也就是说，产品中依然有菌，生物指示剂灭菌后培养时很大概率呈阳性。那么，问题来了，生物指示剂要如何选择，才能证明FPHYHY与FBIO是一致的？根据EP9.0的要求，在进行灭菌工艺验证时，验证时时所选择的灭菌时间（tvl），应将生物指示剂杀灭到10-1到10-3的水平，即
以上述生物指示剂为例，为验证FPHYY和FBIO是一致的，选择的FPHY应将生物指示剂灭菌后的数量NF下降至-1至-3个log值（原来下降至0个log值），即：
即：2×(6+1) ≤tvl≤2×(6+3)
即：14≤tvl≤18 （分钟）
而PDA则建议将生物指示剂杀灭到10-2的水平。（备注：将生物指示剂杀灭到102所需要的时间，即灭菌结束后，生物指示剂全部呈阳性的时间，为生物指示剂的存活时间，survival time；将生物指示剂杀灭到10-4所需要的时间，也即生物指示剂灭菌后全部呈阴性的时间，为生物指示剂的杀灭时间, kill time）。如果验证时，选择的灭菌时间tvl大于kill time，则无法证明FPHY和FBIO具有一致性。这时，我们可以选择减少灭菌时间（如半循环），或降低灭菌温度（这时需要知道生物指示剂在实际灭菌条件下的Z值）来进行灭菌工艺的验证，当然也可以选择合适的生物指示剂，使得该生物指示剂的survival time和kill time满足灭菌参数的要求。
总结：本文介绍了灭菌的原理、灭菌的动力学、灭菌参数和灭菌工艺的选择，在此基础之上，介绍了如何选择合适的生物指示剂，以验证物理杀灭和生物杀灭的一致性。下一部分，我们会根据此理论基础，介绍生物指示剂的种类、选择、使用和质量控制。
