2、冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。
3、离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4、离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心速度和时间，转的不够活细胞沉底的勺，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有DMSO,DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。
5、细胞贴壁少的问题：书中说冻存解冻时1ml细胞液要加10~15ml培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6、复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可以分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7、加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没什么影响，还有一个说法是1%。所以如果你的冻存液的浓度是10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就敲好稀释到无害浓度。
