革兰氏阴性非发酵剂主要是机会致病细菌，普遍存在于环境中，主要影响严重感染和免疫功能低下的患者。 许多这些生物体在医院中成为问题的部分原因是，它们能够在各种栖息地（包括例如水环境，潮湿环境（例如假单胞菌属物种）或干燥表面（例如不动杆菌属物种））中存活。 铜绿假单胞菌是医院感染的主要原因，也是由革兰氏阴性非发酵剂引起的感染最常见的原因，其次是不动杆菌属，嗜麦芽窄食单胞菌和嗜碱杆菌属。 药物敏感性的变化在这些病原体中很常见; 此外，非发酵性革兰阴性杆菌在致病性和传播性方面也有所不同。 因此，对物种水平的鉴定对于患者的正确临床管理是必需的。
除铜绿假单胞菌外，临床实验室中革兰氏阴性非发酵剂的准确鉴定主要依靠市售的表型鉴定系统。用于细菌鉴定的商业系统已经提供了约30年。在原来的手动系统中，只有API 20 NE（法国生物梅里埃）仍然可用，而完全或部分自动化的识别系统，如VITEK（法国生物梅里埃），PHOENIX（BD）和MicroScan（Dade Behring）现已在许多实验室中得到实施。这些系统通过使微生物学家更迅速准确地识别相应的临床相关细菌，有助于更有效地管理患者。然而，所有表型测试系统都有潜在的固有问题，例如，给定物种内的所有菌株都不能表现出特定的特征，相同的菌株可能在重复测试时给出不同的结果，并且相应的数据库是有限的。具体而言，从囊性纤维化患者中回收的非发酵剂可能由于表型变化和生长速度较慢而造成问题，因为这些生物体在这些患者的肺中面临着显着的抗微生物压力。
基因型鉴定方法正在成为已建立的表型鉴定程序的替代或补充方式。对于细菌，16S rRNA基因序列分析是一种被广泛接受的分子鉴定工具。公共数据库（GenBank，欧洲分子生物学实验室的核苷酸序列数据库，日本DNA数据库，RDP II）含有大量的细菌16S rRNA序列，可以进行快速分析并提供具有系统发育意义的信息。迄今为止，很少有研究系统地比较了分子和表型鉴定程序，以确定基于序列的方法对诊断实验室的有用性;可用的研究主要集中在分枝杆菌和革兰氏阳性微生物。在研究有氧革兰氏阴性杆菌的罕见研究中存在一些限制：一些研究仅限于表型给出问题结果的分离株，一些研究仅限于来自囊性纤维化患者的分离株，一些研究仅限于市售的MicroSeq系统。考虑到这些限制，并且为了开发用于微生物实验室的诊断算法，我们在此以前瞻性方式比较了表型系统（API 20 NE，VITEK 2）与16S rRNA基因测序以鉴定临床相关的有氧分离物非发酵革兰氏阴性杆菌。
材料和方法 1
临床分离株
该研究旨在前瞻性比较临床相关的好氧非发酵性革兰氏阴性（非铜绿假单胞菌）棒的表型和分子鉴定。 所调查的分离株（n = 107）从血培养物和需要鉴定的相关临床材料中回收。 在26个月的研究期间，我们的实验室共分离出2,653个好氧革兰氏阴性非发酵剂，其中包括1893株铜绿假单胞菌; 的760非P。 发现107个菌株符合临床相关性标准，因此被纳入研究。
材料与方法 2
使用API 20 NE系统进行识别
API 20 NE系统涵盖61种非肠细菌革兰氏阴性分类群。根据制造商的说明进行测试（bioMérieux，Marcy l'Etoile，法国）。在24和48小时后读取底物同化物。使用识别软件版本6.0在48小时后解释结果。菌株被分为以下三组之一：物种一级的鉴定，属一级的鉴定，无鉴定（即低度鉴别）。根据生产商的说明，物种水平上的菌株鉴定分为4个亚组：优良菌种鉴定，鉴定百分率≥99.9％和T值≥0.75;品种鉴别率很好，鉴定百分率≥99.0％，T值≥0.5;品种鉴别，鉴定百分率≥90.0％，T值≥0.25;可接受的种类鉴定，百分比鉴定≥80.0％和T值≥0.0。
材料与方法 3
使用VITEK 2荧光系统（ID-GNB卡）进行识别
VITEK 2荧光系统（ID-GNB卡）包括43种非肠细菌革兰氏阴性分类群。根据制造商的说明进行测试。简言之，菌株在分离物进行分析前在37℃下在Columbia绵羊血琼脂（Difco 279020）或MacConkey琼脂（BBL 4311391）上培养18至24小时。分析前将储存在-70℃的菌株进行二次传代培养。使用VITEK 2 DensiCheck仪器（bioMérieux）将细菌悬浮液调整至在0.45％氯化钠溶液中的0.50至0.63的McFarland标准。准备溶液和填充卡片之间的时间总是少于1小时。使用包含41种荧光生化测试的革兰氏阴性菌（ID-GNB卡）的识别卡进行分析（13）。卡每15分钟自动读取一次。使用VITEK 2软件版本VT2-R03.1分析数据。未鉴定的分离物用新的亚培养物重新测试。根据生产商的说明，物种水平上的菌株鉴定分为4个亚组：优良品种鉴定，T值≥0.75;非常好的种属鉴定，T值≥0.5和<0.75;良好的品种鉴定，T值≥0.25且<0.5;可接受的物种鉴定，T值≥0.0和<0.25。
材料与方法 4
16S rRNA基因的测序
如前所述进行测序。简而言之，使用溶菌酶（Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Schnelldorf，德国）和碱性溶解消化一定量的细菌细胞。核酸纯化后，使用引物BAK11w [5'-AGTTTGATC（A / C）TGGCTCAG]和BAK2 [5'-GGACTAC（C）]扩增16S rRNA基因的5'部分（相当于大肠杆菌10至806位） / T / A）AGGGTATCTAAT]（4）。循环参数包括在95℃初始变性5分钟; 40个循环，94℃1分钟，48℃1分钟，72℃1分钟;并在72℃下最后延伸10分钟。在含有1.25U AmpliTaq DNA聚合酶LD（Applied Biosystems，Rotkreuz，瑞士）的总体积50μl中使用5微升DNA提取物进行扩增。扩增子纯化并用正向引物BAK11w测序，并使用自动DNA测序仪（ABI Prism 3100 Genetic Analyzer; Applied Biosystems）分析片段。
材料与方法 5
序列分析
使用两步法将16S rRNA基因序列与GenBank，EMBL和DDBJ数据库中的序列进行比较。首先用Wisconsin GCG程序包的FASTA算法进行搜索。所有显示与最佳评分参考序列不同的位置在电泳图中用肉眼检查，如有必要，手动校正序列。此后，使用BLASTN进行第二次搜索。将确定的序列或参考序列中的未确定的核苷酸（命名为N）计数为匹配。手动编辑后序列的平均长度为508±104个核苷酸（范围，315至692个核苷酸），含有0.8±1.5个未确定的（N）位置（范围0至9N）。
为了鉴定，使用以下标准：当确定的序列与分类物种的参考序列产生≥99％的相似性分数时，将未知分离物分配给该物种;当分数<99％且≥95％时， ，未知的分离物被分配给相应的属;当分数<95％时，未知的分离物被分配给一个家庭。如果未知的分离物被分配到一个物种，并且得分列表中的第二个分类物种显示出小于0.5％的附加序列分歧，则这被分类为“与下一物种的分界低的物种”。
材料与方法 6
差异分析
根据Stackebrandt和Goebel，16S rRNA基因相似性小于97％表明菌株属于不同物种。 如果根据表型和分子标准将分离物分配到不同的物种，则程序如下：如果分离物的序列与表型分配的物种的序列显示少于97％的相似性，则认为分离物具有 不属于通过表型手段鉴定的物种，测序结果被认为是正确的; 如果分离物的序列显示与通过表型手段分配的物种的序列97％至99％的相似性，则分离物被分类为未分离的。
结果
通过核糖体RNA基因测序鉴定
在研究期间，共回收了107个临床相关的好氧非发酵革兰氏阴性杆菌（非铜绿假单胞菌）分离株。分离株是13个不同属的代表。使用定义的标准，16S rRNA基因测序导致将98个分离物分配到物种水平，并将9个分离物分配到属水平。在物种层次鉴定的98个菌株中，有12个与公共数据库进行序列比较，结果发现两个不同物种的序列具有相同的相似性评分;因此，该分离物未被分配到单一分类群中，但据报道属于两种物种中的任一种。例如，分离株的序列与荧光假单胞菌和杰氏假单胞菌的序列显示100.0％的同一性。在物种水平鉴定的98个分离株中有25个被鉴定为对下一个物种具有低分界的物种，即与另一个序列条目的另外的序列差异小于0.5％。作为低分界的例子，分离株的序列显示99.8％的相似性与木糖氧化无色杆菌的序列相似，与无色无色杆菌序列有99.4％的相似性。因此，总共有37种分离物不能毫无歧义地分配给一个物种。其中14株为洋葱伯克霍尔德氏菌复合群，9株属于鲍曼不动杆菌 - 钙不动杆菌复合群及其近亲属，8株属于假单胞菌属，4株为木糖氧化无色杆菌，2株为劳尔氏菌属。
