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绿色木霉耐高温葡萄糖氧化酶的特性分析

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-10-11
核心提示:葡萄糖氧化酶(GOD)是一种需氧脱氢酶,全称为β-D-吡喃型葡萄糖需氧脱氢酶,它可以在有氧条件下专一性地催化β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸-1,5-δ-内酯和伴随的分子氧还原为过氧化氢,在水相体系中D-葡萄糖酸-1,5-δ-内酯自动水解为葡萄糖酸。
   葡萄糖氧化酶(GOD)是一种需氧脱氢酶,全称为β-D-吡喃型葡萄糖需氧脱氢酶,它可以在有氧条件下专一性地催化β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸-1,5-δ-内酯和伴随的分子氧还原为过氧化氢,在水相体系中D-葡萄糖酸-1,5-δ-内酯自动水解为葡萄糖酸。GOD对多种糖有氧化性,但葡萄糖、2-脱氧-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖共同存在时,GOD对葡萄糖有非常高的催化特异性,而对其他糖氧化能力极其微弱。
 
  徐州工程学院食品(生物)工程学院的高兆建、王先凤、尚业成等人采用实验室筛选到的1 株高产GOD的绿色木霉(Trichoderma viride),从其发酵液中分离纯化到高纯度酶制剂(TvGOD),所产TvGOD耐高温耐酸性及抗逆性显着,有潜力在工业生产中使用。
 
  1TvGOD的分离纯化
 
  不含酶活力的大量杂蛋白峰在低中浓度NaCl条件下先被洗脱下来,而后随着NaCl浓度的提高,大量蛋白被洗脱下来,对收集管检测酶活力显示,酶活洗脱峰与第3大蛋白洗脱峰基本重合,接着在高NaCl浓度条件下杂蛋白被洗脱下来。测定结果表明,在该分离条件下,蛋白组分与杂质分子实现了较好分离,有酶活力的对应收集管合并后用于后续纯化操作。经过离子交换层析,TvGOD比活力达到134.47 U/mg,酶回收率为52.80%,纯化倍数为4.53。
 
  2TvGOD纯度和分子质量测定
 
  经DEAE-Sepharose Fast Flow分离后酶液中还含有大量杂蛋白;Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析后,杂蛋白显着降低,但仍有多条清晰条带;而经Sephadex G-75分子筛凝胶过滤色谱柱分离后的酶液仅有1 条条带,说明采用以上分离纯化后已获得纯度较高的TvGOD。经计算其分子质量约为93 kDa。
 
  3TvGOD酶学性质分析
 
  01
 
  TvGOD最适作用温度及热稳定性
 
  在20~60 ℃酶活力随温度的升高而增加,在20~40 ℃之间酶活力增加幅度较小,40 ℃时相对酶活力约为30%;在40~50 ℃酶活力随温度升高急速增加,50~60 ℃酶活力随温度升高活力增加速度变缓,当温度达到60 ℃时,酶活力达到最高;随后酶活力逐渐降低,但当温度达到70 ℃时酶活力还能达到75%,说明该酶最适反应温度为60 ℃,可以看出该酶嗜高温,在实际生产中有较好的应用前景。
 
  02
 
  pH值对酶活力和酶稳定性的影响
 
  pH 3.0~6.0范围内酶活力随pH值升高而增加,当pH值超过6.0时,酶活力急速下降,故酶最适作用pH 6.0。pH 3.0~4.0酶活力增加较为显着;当pH值超过4.0时酶活力增加幅度减缓。pH 5.0时相对酶活力为85%,pH 7.0时相对酶活力为87%,但当pH 10.0时,酶活力几乎测不到,故TvGOD适合弱酸性条件下使用。
 
  03
 
  金属离子及抑制剂对TvGOD活力的影响
 
  在5 mmol/L离子浓度下,Mg2+和Ca2+对酶均有激活作用,其中Mg2+激活作用更为显着,相对酶活力达到138%,Ca2+的相对酶活力达到112%;Na+和K+对酶活力几乎没有影响,但Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+对酶活力有轻微的抑制作用,而Hg2+和Pb2+几乎能够完全抑制酶活力;表面活性剂SDS、CTAB、Tween-80、Trition X-100对酶活力有轻微抑制作用;金属螯合剂EDTA对酶的抑制作用较弱;PSFM对酶活力抑制作用非常强烈,酶活力仅有10.2%。
 
  04
 
  TvGOD动力学分析
 
  利用不同浓度葡萄糖(10~80 mmol/L)作为底物,测定TvGOD的反应初速率。按照米氏方程,采用Lineweaver-Burk双倒数作图,求得TvGOD的表观米氏常数Km为11.62 mmol/L,最大反应速率Vmax为8.244 mmol/(L·min)。
 
  结 论
 
  与报道相比,本研究所应用的纯化方法所得酶的比活力和纯化倍数均较高,主要源于采用了3 种柱层析方法,而报道的大多采用两种层析技术,本研究增加了疏水层析,更为有效地去除了杂蛋白、色素等杂质,而对酶的回收率影响不大。在传感器领域,GOD的纯度、特异性以及苛刻环境的耐受性对传感器的灵敏度、专一性及使用寿命具有重要影响。本研究纯化的方法,在酶的纯度和酶比活力方面具有较大优势,所纯化酶制剂适用于对酶纯度较高的研究中。但因纯化环节多,酶的回收率偏低。因此,从成本和纯化的规模考虑,本纯化的方法可以借鉴,并需要进一步深入研究。
 
 
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