徐州工程学院食品（生物）工程学院的高兆建、王先凤、尚业成等人采用实验室筛选到的1 株高产GOD的绿色木霉（Trichoderma viride），从其发酵液中分离纯化到高纯度酶制剂（TvGOD），所产TvGOD耐高温耐酸性及抗逆性显着，有潜力在工业生产中使用。
1TvGOD的分离纯化
不含酶活力的大量杂蛋白峰在低中浓度NaCl条件下先被洗脱下来，而后随着NaCl浓度的提高，大量蛋白被洗脱下来，对收集管检测酶活力显示，酶活洗脱峰与第3大蛋白洗脱峰基本重合，接着在高NaCl浓度条件下杂蛋白被洗脱下来。测定结果表明，在该分离条件下，蛋白组分与杂质分子实现了较好分离，有酶活力的对应收集管合并后用于后续纯化操作。经过离子交换层析，TvGOD比活力达到134.47 U/mg，酶回收率为52.80%，纯化倍数为4.53。
2TvGOD纯度和分子质量测定
经DEAE-Sepharose Fast Flow分离后酶液中还含有大量杂蛋白；Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析后，杂蛋白显着降低，但仍有多条清晰条带；而经Sephadex G-75分子筛凝胶过滤色谱柱分离后的酶液仅有1 条条带，说明采用以上分离纯化后已获得纯度较高的TvGOD。经计算其分子质量约为93 kDa。
3TvGOD酶学性质分析
01
TvGOD最适作用温度及热稳定性
在20～60 ℃酶活力随温度的升高而增加，在20～40 ℃之间酶活力增加幅度较小，40 ℃时相对酶活力约为30%；在40～50 ℃酶活力随温度升高急速增加，50～60 ℃酶活力随温度升高活力增加速度变缓，当温度达到60 ℃时，酶活力达到最高；随后酶活力逐渐降低，但当温度达到70 ℃时酶活力还能达到75%，说明该酶最适反应温度为60 ℃，可以看出该酶嗜高温，在实际生产中有较好的应用前景。
02
pH值对酶活力和酶稳定性的影响
pH 3.0～6.0范围内酶活力随pH值升高而增加，当pH值超过6.0时，酶活力急速下降，故酶最适作用pH 6.0。pH 3.0～4.0酶活力增加较为显着；当pH值超过4.0时酶活力增加幅度减缓。pH 5.0时相对酶活力为85%，pH 7.0时相对酶活力为87%，但当pH 10.0时，酶活力几乎测不到，故TvGOD适合弱酸性条件下使用。
03
金属离子及抑制剂对TvGOD活力的影响
在5 mmol/L离子浓度下，Mg2＋和Ca2＋对酶均有激活作用，其中Mg2＋激活作用更为显着，相对酶活力达到138%，Ca2＋的相对酶活力达到112%；Na＋和K＋对酶活力几乎没有影响，但Mn2＋、Fe2＋、Cu2＋和Zn2＋对酶活力有轻微的抑制作用，而Hg2＋和Pb2＋几乎能够完全抑制酶活力；表面活性剂SDS、CTAB、Tween-80、Trition X-100对酶活力有轻微抑制作用；金属螯合剂EDTA对酶的抑制作用较弱；PSFM对酶活力抑制作用非常强烈，酶活力仅有10.2%。
04
TvGOD动力学分析
利用不同浓度葡萄糖（10～80 mmol/L）作为底物，测定TvGOD的反应初速率。按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk双倒数作图，求得TvGOD的表观米氏常数Km为11.62 mmol/L，最大反应速率Vmax为8.244 mmol/（L·min）。
结 论
与报道相比，本研究所应用的纯化方法所得酶的比活力和纯化倍数均较高，主要源于采用了3 种柱层析方法，而报道的大多采用两种层析技术，本研究增加了疏水层析，更为有效地去除了杂蛋白、色素等杂质，而对酶的回收率影响不大。在传感器领域，GOD的纯度、特异性以及苛刻环境的耐受性对传感器的灵敏度、专一性及使用寿命具有重要影响。本研究纯化的方法，在酶的纯度和酶比活力方面具有较大优势，所纯化酶制剂适用于对酶纯度较高的研究中。但因纯化环节多，酶的回收率偏低。因此，从成本和纯化的规模考虑，本纯化的方法可以借鉴，并需要进一步深入研究。
