检测方法：
1.SYBRGreenⅠ法:
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图
PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性)
2.TaqMan探针法:探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
在进行实时荧光定量PCR引物设计之前，大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则.
1）引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）
引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
2）引物长度一般在15~30碱基之间
引物长度（primer length）最好是17~25 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3）GC含量
引物GC含量在40%~60%之间，最好在45~55%。
4）有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。两条引物Tm值尽量接近。
5）碱基要随机分布
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
6）引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。
7）关于设计软件，
PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的，还有很多在线引物设计网站，比如：
1、Primerbank。
网址：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
2、Primer3plus。
网址;http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
