鸡蛋壳中含有丰富的钙，是一种天然的绿色钙源，可用作碳酸钙材料，形成不同的钙盐。而蛋壳乳酸钙与其他有机钙盐相比具有良好的溶解性和生物利用度。目前蛋壳乳酸钙主要可以通过煅烧、直接中和或发酵方法制成，与前两种方法相比，发酵方法具有绿色无污染且成本低的优势，符合我国的可持续发展方向。然而，微生物发酵法制备乳酸钙产率低，这很大程度限制了蛋壳废物的有效利用。
考虑到蛋壳废物的主要成分碳酸钙可有效提供钙离子，以解决SA-氯化钙体系中机械稳定性差的问题，华中农业大学食品科学技术学院，国家蛋品加工技术研发中心的赵静丽、刘远远和马美湖*等人采用SA、海藻酸钠-聚乙烯醇（SA-PVA）、海藻酸钠-活性炭（SA-C）作为包埋载体，通过比较其机械强度、传质系数、细胞操作稳定性等指标选择最适的包埋载体，并对最适包埋载体的性质进行研究，以期为固定化细胞技术有效利用蛋壳废物生产乳酸钙提供一定的理论基础，以实现工业连续发酵的要求。
蒙氏肠球菌的生长曲线
结果显示，在2 h后，菌种开始进入对数生长期，相应的pH值也在急速下降，并在10 h左右达到稳定期，其OD600 nm值与pH值趋于稳定。由于处于对数生长期的微生物代谢旺盛，生长速率最大，在实际生产中通常选择对数期的微生物作为种子，使微生物发酵的延迟期缩短，而用于固定化的微生物要求生长旺盛，因此，实验选择培养10～12 h的菌种进行固定化，以提高微生物的利用效率。
不同载体固定化细胞的机械强度和传质系数
结果显示，3 种载体中SA载体固定化细胞的机械强度值最大，而SA-PVA载体固定化细胞的传质系数值最大。在实际生产中，固定化细胞机械强度较低时，其固定化颗粒内部交联结构的致密程度低，利于增加其内部传质，但易使被固定的细胞泄漏、凝胶球破碎，且固定之后经过洗涤会造成菌体损失，从而不利于其发酵并失去连续发酵的意义。而当机械强度较高时，凝胶过于紧密，会降低其传质性，不利于底物和产物的扩散，从而导致其发酵性能降低。因此，固定化细胞的机械强度并不是越大（或小）对发酵就越有利。在比较3 种载体固定细胞的机械强度及传质系数后，选择载体为SA-C为宜。
游离细胞与不同载体固定化细胞生产乳酸钙产量的比较
结果显示，游离细胞与S A、S A-C 及S A-P VA 3 种载体固定化细胞随着发酵时间的延长，其乳酸钙产量显着增加（P＜0.05），并在72 h达到最大值，分别为（102.01±2.56）、（96.33±1.86）、（101.02±1.83）、（76.09±1.97）g/L，且SA-C载体的固定化细胞其乳酸钙产量比其他2 种载体的乳酸钙产量高，而与游离细胞相当。
游离细胞与不同包埋载体固定化细胞的操作稳定性
为更好地确定包埋载体，对3 种载体固定化细胞及游离细胞进行重复发酵实验，结果显示，仅在重复发酵9 次时，游离细胞中乳酸钙产量与初始值相比降低近半，而SA-PVA载体固定化细胞机械稳定性比较差，在发酵过程中有部分溶解，在重复使用12 次时已大部分溶解，不利于实际生产的使用。SA载体在重复使用18 次后，其乳酸钙产量仍保留在80%以上，而SA-C载体在重复使用10 次之后，其发酵周期缩短为48 h即可达到 第1次产乳酸钙的含量，并且由于发酵液中蛋壳粉的存在，可提供钙离子，避免了固定化小球出现机械强度差的问题，始终维持着良好的机械稳定性。
不同载体固定化细胞的微观结构
图4A显示，SA载体表面光滑，不利于其菌体细胞的附着；由图4B可以看到，SA-C载体的表面粗糙，为固定在其上的菌体细胞提供良好的附着微环境；由图4C可知，SA-PVA载体表面有许多空隙，具有较大的比表面积利于菌体细胞的附着。而观察图4D～F可知，SA、SA-C两种包埋载体内部均成功的附着有大量菌体细胞，且菌体细胞颗粒饱满，而SA-PVA包埋载体内部图发现出现了许多小孔，且没有发现菌体的附着；在重复发酵18 次后，由图4G、H可知，SA-C与SA载体固定化细胞内部相比聚集了更多的菌体细胞，且内部构造强度仍然很好，维持着高密度细胞发酵，有利于乳酸钙产量的提高。因此，最终选择SA-C载体作为固定化蒙氏肠球菌的最适包埋载体。
葡萄糖加入量对乳酸钙产量的影响
在确定SA-C作为最适包埋载体后，对发酵液中葡萄糖加入量对乳酸钙产量的影响进行探究，结果显示，随发酵液中葡萄糖加入量增加，乳酸钙产量呈现先增加后降低的趋势，在葡萄糖加入量为120 g/L时乳酸钙产量最高，达（100.07f 2.58）g/L，且蛋壳粉转化率为82.43%。随着葡萄糖加入量的继续增加反而使乳酸钙产量降低。因此，综合考虑选择发酵液中的葡萄糖加入量为120 g/L。
蛋壳粉加入量对固定化细胞机械强度的影响
结果显示，发酵液中加入不同量蛋壳粉对固定化细胞机械强度的影响具有显着差异（P＜0.05）。在发酵72 h后，没有加入蛋壳粉的固定化细胞机械强度明显降低，不利于实际应用，易造成凝胶破裂、细胞渗漏。而发酵液中加入蛋壳粉的固定化细胞，由于蛋壳粉的存在，其主要成分是碳酸钙，可为凝胶体系补充钙离子从而防止凝胶体系中的钙离子因被发酵液中磷酸盐等离子置换出来，而导致凝胶体系破裂的现象。结果说明蛋壳粉的存在有效维持了固定化细胞在长期发酵过程中的机械稳定性。
温度和pH值对乳酸钙产量的影响
结果显示，游离细胞与固定化细胞的最适温度相同，乳酸钙产量均在38 ℃时达到最大值，当温度过高或者过低时，均不利于乳酸钙的生成，而固定化细胞对不同温度的适应能力明显高于游离细胞。在最适反应温度条件下，游离细胞与固定化细胞最适宜的pH值都为5.7，说明固定化以后没有改变蒙氏肠球菌生长适宜的pH值，而在pH值过低或过高时，固定化细胞生产乳酸钙的能力高于游离细胞，说明将细胞固定化之后提高了其pH值稳定性。
固定化细胞的贮存稳定性
将固定化细胞与游离细胞分别置于无菌生理盐水中，于冰箱中4 ℃保存。如图7所示，随着贮存时间的延长，固定化细胞的贮存稳定性明显高于游离细胞，且在4 ℃冷藏54 d后，乳酸钙产量与新制备的固定化细胞相比仅下降13.45 g/L，由此说明固定化细胞具有良好的贮存稳定性。
结 论
本研究采用固定化细胞技术利用蛋壳废物生产乳酸钙，对固定化包埋载体进行探讨，并确定SA-C作为最适包埋载体，其产乳酸钙能力与游离细胞相当，在重复发酵18 次后仍维持高产率的乳酸钙。而发酵液中蛋壳废物的存在既维持了固定化细胞的机械稳定性，又与乳酸充分结合生成乳酸钙，有效提高了蛋壳废物的利用。与游离细胞相比，固定化细胞的操作稳定性、温度、pH值及贮存稳定性在一定范围内都有明显的提高，为利用固定化细胞技术生产蛋壳乳酸钙提供一定的理论支持，且所制得的凝胶球可满足连续化发酵生产工艺的要求。
