众所周知，白酒酿造的产质量与酿造过程微生物菌群结构及其代谢密不可分，清酱香型白酒风格之所以不同于典型的清香型和酱香型白酒，除在酿造工艺上的创新和不同外，更根本原因在于其酿酒微生物结构的差异和酿造环境的独特。目前研究普遍认为，在白酒酿造微生物体系中，细菌有产酶和产香的能力，通过代谢产生丰富的风味物质决定白酒的香型和品质。白酒酿造过程中细菌群落结构也一直是白酒界的研究热点。
清酱香白酒作为创新香型白酒，还处于发展起步阶段，酿造过程的细菌群落结构体系尚不明确，这在一定程度上制约了它的发展。因此，为揭示酿酒微生态、功能微生物多样性结构对清酱香型人民小酒酿造及其酒体风格影响的机理以及清酱香型白酒酿造过程中重要发酵微生物的调节机制，贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室的胡小霞，黄永光*和贵州岩博酒业有限公司的蒋想等人通过高通量测序策略并结合数理统计系统，分析清酱香型白酒陶坛发酵过程中的细菌群落结构，并进一步研究其主要细菌群落在发酵过程中的变化规律及调控机制，以期推动清酱香型白酒的创新发展。
一、陶坛发酵过程细菌群落结构分析
对两组样品细菌的高通量测序结果进行统计分析，图2为清酱香型白酒陶坛发酵过程的细菌群落结构气泡图。
从YB1中检出11 个门，从YB2中检出9 个门，YB1和YB2酒醅样品中共检出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、p_unclassified_k__norank、Fusobacteria、Saccharibacteria、Planctomycetes、Acidobacteria 11 个门，其中优势细菌门（平均相对丰度＞10%）为Firmicutes（67.09%）和Proteobacteria（31.42%），这与清香型和酱香型白酒发酵过程的优势细菌门一致。Firmicutes在清酱香型白酒发酵酒醅中占绝对主导地位，在清香型和酱香型白酒发酵酒醅中同样如此，但丰度占比有所差异。
从YB1中检出166 个属，从YB2中检出146 个属，YB1和YB2酒醅样品中共检出178 个属。如图2所示，有21 个属相对丰度至少在一个样品中超过1%，分别是：Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Leuconostoc、g_unclassified_o_Bacillales、Gluconobacter、Pseudomonas、Acetobacter、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Kozakia、Pantoea、Psychrobacter和g_unclassified_c_Alphaproteobacteria、Chryseobacterium。
上述21 个细菌属中，Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus和Pediococcus属于乳酸菌。
Gluconobacter、Acetobacter、Komagataeibacter和Kozakia属于醋酸菌。Weissella和Leuconostoc可启动发酵，Leuconostoc还可利用葡萄糖进行异型乳酸发酵产生D-型乳酸和乙酸。Gluconobacter能产生乙酸。Acetobacter能产细菌纤维素，具有氧化乙醇生成乙酸并进一步氧化乙酸的能力。Komagataeibacter的部分菌株可产生细胞纤维素。Kozakia能利用蔗糖或D-果糖生产类似果聚糖的黏性物质，也能氧化乙酸盐和乳酸盐，利用乙醇生产食醋。Oceanobacillus是大曲中的主要微生物，具有产乳酸的功能。Bacillus是酱香型白酒生产中的主要功能菌，能在55 ℃及以上高温下生长，促进以葡萄糖、甘氨酸和氯化钠为原料的美拉德反应迅速发生，是重要的产酸和产香菌，促进浓郁的酱香风味形成；并且Bacillus还能代谢酶水解淀粉、蛋白质等，产生丁酸和己酸等，还有助于双乙酰等芳香物质和吡嗪、醛类、酮类、醇类等挥发性化合物形成。Enterobacter存在于大曲和小曲中。Acinetobacter是具有呼吸和发酵代谢作用的细菌，以葡萄糖和其他碳水化合物代谢产酸，是酱香型和清香型白酒酒醅中的主要微生物。综上表明，上述微生物具有促进清酱香白酒风味物质富集的作用。
Pseudomonas是清香型白酒酒醅中的主要微生物。清香型或酱香型白酒发酵过程中的主要微生物，如果在清酱香型白酒中的相对丰度较高（相对丰度＞1%），对清酱香型白酒发酵也有一定影响作用。
高通量测序结果表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter和Komagataeibacter在酒醅中的平均相对丰度大于1%，Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea在发酵结束阶段平均相对丰度大于1%。以上微生物在清酱香型白酒陶坛发酵过程中的相对丰度及其功能作用表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobcter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea共17 种属是清酱香型白酒发酵过程的主要细菌属。其中优势细菌属（平均相对丰度＞10%）为Weissella（20.61%）、Staphylococcus（14.19%）、Lactobacillus（12.08%）和Gluconobacter（14.17%）。
如图3所示，Weissella、Lactobacillu、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Acinetobacter和Leuconostoc是清香型和清酱香型白酒酒醅共有的主要细菌属，Streptpcoccus和Aerococcus在清香型白酒酿造中是主要细菌属，但Streptpcoccus在清酱香型白酒发酵过程中未检出，Aerococcus在清酱香型白酒发酵过程中含量很低（在各样品中相对丰度均低于0.01%）。酱香型白酒酒醅中的主要细菌属为Acidithiobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus、Bacillus、Pantoea、Weissella、Thermoactinomyces、Enterobacter、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto 1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Acinetobacter、Lactococcus、Staphylococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospor。其中Weissella、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Acinetobacter、Pantoe是酱香型和清酱香型白酒酒醅共有的主要细菌属，Acidithiobacillus、Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Lactococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospora、Serpens是酱香型白酒酒醅中的主要细菌属，但Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在清酱香型白酒发酵过程中未检出，Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Lactococcus和Enhydrobacter在清酱香型白酒发酵过程中含量很低（在各样品中平均相对丰度介于0%～0.35%）。与清香型和酱香型白酒相比，Gluconobacter、Oceanobacillus、Lentibacillus、Komagataeibacter、Kozakia是清酱香型白酒酒醅中特有的主要细菌属。正是由于发酵菌群结构的差异，其发酵动力和风味动力上也会存在差异，从而导致了酱香、清香、清酱香白酒发酵产率及其酒体风格特征上的差异。
上述结果表明，在门水平，清酱香、清香、酱香型白酒酿造微生物差异不大，都是Firmicutes和Proteobacteria为优势细菌门，且Firmicutes占主导地位。在属水平，清酱香型白酒酿造过程主要细菌属与清香型、酱香型白酒堆积发酵过程的主要细菌属有很大重合，但又有各自特有的主要细菌属。说明清酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构与清香型白酒、酱香型白酒酿造均有一定的相似性，但又不同于清香型白酒和酱香型白酒酿造细菌群落结构，具有其自身独特性。清酱香型白酒酿造过程的主要细菌群落结构兼具了清香和酱香白酒酿造主要细菌的群落结构特点。
二、发酵起始和结束阶段细菌群落结构
2.1 发酵起始和结束阶段酒醅样品与物种共线性分析
对两车间发酵1 d和发酵20 d酒醅样品的细菌进行相关性分析，结果见图4。对比YB1发酵起始（1F 1 d）和发酵结束（1F 20 d）时的酒醅，从图4a可看出，有Candidatus_Saccharimonas等6 个属只出现在发酵1 d酒醅中，发酵结束时未检出，说明这6 个属受发酵条件调控明显。这6 个属在发酵1 d时相对丰度和占0.03%，在发酵过程所占菌群结构比例很小。此外，有56 个属在发酵1 d未检出，但在发酵结束阶段检出（相对丰度和占0.48%），这些属与发酵工艺变化存在协同性，并富集于发酵过程。
值得注意的是，有79 个属同时出现在发酵开始和结束阶段，其中有73 个属同时出现在YB1的4 个采样阶段，在各阶段的丰度和分别占99.96%、98.91%、99.38%和98.05%，表明这些属在发酵过程起主导性作用。对比YB2酒醅在发酵开始（2F 1 d）和发酵结束（2F 20 d）阶段的菌群结构（图4b）可知，有26 个属只出现在发酵1d，发酵结束时未检出，这部分属在发酵1 d的相对丰度和占0.20%。此外，有33 个属在于发酵1 d未检出，但在发酵结束时有检出，其相对丰度和占0.20%。同时出现在发酵开始和结束阶段的有79 个属，其中有66 个属同时出现在YB2样品的4 个采样阶段，这66 个属在各阶段的丰度和分别占99.68%、99.54%、99.60%和97.83%，同样表明这些属在发酵过程具有重要作用。
在YB1酒醅样品中，共检出166 个属，有43.96%的属存在于发酵起始阶段并稳定迁移、维持至发酵结束阶段，这些属在各阶段的相对丰度和高达98%以上。另外，有33.73%的属在发酵起始阶段未检出，在发酵进程中富集，但在发酵结束时相对丰度和仅占0.48%。在YB2酒醅中共检出146 个属，有45.21%的属从发酵起始阶段一直稳定至发酵结束，其在各阶段的相对丰度和高达97.83%以上。另外，有22.60%的属在发酵起始阶段未检出，但在发酵过程得到富集，到发酵结束时相对丰度和为0.20%。
上述结果表明，在清酱香型白酒（人民小酒）发酵过程中，YB1、YB2平均有10.71%的细菌发生消亡，同时平均有28.17%的新物种得到富集，但其相对丰度和均不超过1.9%，所起的调控和发酵作用不明显，起主导作用的微生物菌群从发酵起始阶段就存在并稳定维持至发酵结束。虽然两个车间的微生物存在一定差异，但调控发酵的主要微生物结构相似度高，且稳定性较好，部分微生物存在差异主要来源于随发酵时间延长，发酵工艺参数变化和微生物结构变化之间的相互影响和调控。
2.2 发酵起始和结束阶段主要细菌群落差异分析
根据上述主要细菌菌群丰度数据，运用统计学方法，对发酵1 d和发酵20 d酒醅的主要细菌属进行假设检验，评估物种丰度差异的显着性水平，获得发酵起始和结束阶段样品的显着性差异物种及主要细菌属变化结果，以进一步解析发酵过程主要细菌属的调控作用，结果如图5所示。
上述17 个主要细菌属，在YB1（图5a）中相对丰度高度显着（P＜0.001）下降的有Weissella、Gluconobacter和Pseudomonas 3 个属，其余14 个属全部呈高度显着（P＜0.001）上升。在YB2（图5b）中相对丰度下降的有Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus、Bacillus和Lentibacillus 5 个属，其余12 个属相对丰度呈现上升。其中，Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus和Lentibacillus 4 个属相对丰度呈现高度显着（P＜0.001）下降，Lactobacillus、Pseudomonas、Acetobacter、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc和Pantoea 11 个属相对丰度呈现高度显着（P＜0.001）上升，Bacillus和Kozakia无显着性变化（P＞0.01）。
同时也可看出，在发酵阶段，主要细菌属的相对丰度存在变化。两个车间平均73.53%的主要细菌属呈现高度显着（P＜0.001）上升，平均20.59%的主要细菌属呈现高度显着（P＜0.001）下降，仅有2 个属无显着性变化。发酵结束阶段，细菌群落组成结构相对比较稳定，没有占绝对优势的微生物。在YB1中仅有Gluconobacter和Staphylococcus两个属是优势细菌属，相对丰度分别是18.20%和20.46%；在YB2也只有Weissella和Lactobacillus两个属是优势细菌属，相对丰度分别为12.03%和25.97%。
综上，发酵阶段会发生主要细菌群落结构的内部调控机制，平均73.53%的主要细菌属相对丰度呈高度显着（P＜0.001）上升，20.59%的主要细菌属相对丰度呈高度显着（P＜0.001）下降。细菌在发酵过程的含量变化主要受发酵过程发酵酒醅理化指标变化和微生物群落结构的双向调控。到发酵结束阶段，因酒醅理化指标所导致的发酵环境相对稳定，所以该阶段的主要细菌组成结构呈现相对稳定，其相对丰度均小于25.97%。
三、主要细菌群落之间相关性
为深入挖掘主要细菌群落之间的相关性及其变化规律，采用网络分析方法对17 个主要细菌属进行了相关性分析，结果如图6所示。从图6可看出，发酵过程平均81.12%的细菌菌属之间呈显着正相关（P＜0.05）。在YB1中，正相关性占总相关性的85.19%，负相关性占总相关性的14.81%。在YB2中，正相关性占总相关性的77.05%，负相关性占总相关性的22.95%。表明这些微生物菌群在发酵过程存在一定程度上相似生态位。
Hubs种类及多少在一定程度上可反映特定环境中微生物菌群结构的稳定性。从YB1的同现性网络图谱（图6a）中共发现Komagataeibacter、Pantoea、Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus、Pediococcus、Staphylococcus和Bacillus 8 个Hubs（这里指至少与其他4 个属的微生物存在正相关的节点）。Komagataeibacter是Proteobacteria门下的醋酸菌，与Bacillus、Kozakia、Acetobacter、Pantoea、Pediococcus和Enterobacter显着正相关（P＜0.05）。Pantoea与Leuconostoc显着正相关（P＜0.05）。Lentibacillus与Oceanobacillus、Staphylococcus和Kroppenstedtia显着正相关（P＜0.05）。Bacillus与Pantoea显着正相关（P＜0.05）。Staphylococcus与Oceanobacillu和Kroppenstedtia显着正相关（P＜0.05）。Pediococcus与Bacillus、Leuconostoc和Pantoea显着正相关（P＜0.05）。Lentibacillus与Oceanobacillu、Staphylococcus和Kroppenstedtia显着正相关（P＜0.05）。Enterobacter与Bacillus、Staphylococcus、Oceanobacillu和Lentibacillus显着正相关（P＜0.05）。从YB1的负相关网络（图6b）可发现Pseudomonas 1 个负相关Hub（这里指至少与其他3个属的微生物存在负相关的节点）。Pseudomonas与Gluconobacter、Acetobacter和Kozakia显着负相关（P＜0.05），此外乳酸菌Weissella和醋酸菌Acinetobacter显着负相关（P＜0.05）。
从YB2的共现性网络图谱（图6c）中共发现10 个Hubs，分别是Firmicutes下的Pediococcus、Lactobacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus和Leuconostoc；Proteobacteria下的Komagataeibacter、Acetobacter、Enterobacter、Acinetobacter和Pantoea。这些微生物中，除Leuconostoc与Acinetobacter，Kroppenstedtia与Oceanobacillus、Pediococcus之间相关性不显着外（P＞0.05），其余全部两两显着正相关（P＜0.05）。从YB2的负相关网络（图6d）发现Staphylococcus和Pseudomonas两个Hubs。Staphylococcus与Acetobacter、Leuconostoc、Pantoea、Enterobacter、Komagataeibacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus和Acinetobacter显着负相关（P＜0.05），这几个微生物属全都是正相关Hubs。而在YB1中，Staphylococcus与Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus和Kroppenstedtia显着正相关（P＜0.05）。该结果与Staphylococcus在两个车间的含量不同有关。在YB1中，Staphylococcus总体呈上升趋势，相对丰度从起发阶段的9.07%上升至发酵结束时的20.46%。而在YB2，Staphylococcus的相对丰度从起酵时的28.03%下降至发酵结束时为0.95%。在YB2中，Pseudomonas和Lentibacillus、Bacillus、Kozakia显着负相关（P＜0.05），Pseudomonas在YB1中也与3 个属的微生物存在显着负相关（P＜0.05）。
从主要细菌群落在两个车间酒醅的相关性分析结果发现，其发酵过程平均81.12%的主要细菌菌属之间呈显着正相关（P＜0.05），18.88%的主要细菌菌属之间呈显着负相关（P＜0.05）。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清酱香型白酒（人民小酒）两个车间发酵体系中共有的正相关Hubs，对维持发酵体系的正常、稳态发展和酒体风味的形成起到非常重要的作用。Pseudomonas是两个车间发酵体系中共有的负相关Hub。
结 论
清酱香型白酒发酵过程的优势细菌门与清香型、酱香型白酒相同，均为Firmicutes和Proteobacteria，主要细菌属为Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea，优势细菌属为Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus和Gluconobacter。Streptpcoccus在清香型白酒酿造过程中是主要细菌属，Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto 1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在酱香型白酒酒醅中是主要细菌属，但在清酱香型白酒发酵过程中均未检出。与清香型、酱香型白酒酿造过程微生物对比，清酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构与清香型白酒、酱香型白酒酿造均有一定的相似性，但又不同于典型的清香型和酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构，具有其自身独特性，本研究对清酱香型白酒酿造微生物群落结构差异分析，为探究清酱香型白酒风味形成的微生物成因（菌系基础）和风味特征凝练和品质创新奠定了必要基础。
发酵过程平均有10.71%的细菌发生消亡，平均28.17%的物种得到富集，但其相对丰度都很低，相对丰度和均小于1.9%；主要细菌属的群落组成结构发生了变化，平均73.53%的主要细菌属呈高度显着上升，20.59%的菌属呈高度显着下降。在发酵结束阶段，主要细菌群落组成结构相对稳定，相对丰度均不超过25.97%；发酵过程，平均81.12%的主要细菌菌属之间呈显着正相关，18.88%的主要细菌菌属之间呈显着负相关。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清酱香型白酒（人民小酒）发酵体系中共有的正相关Hubs，对维持清酱香白酒发酵体系的正常、稳态发展和酒体风味的形成起了非常重要的作用。
