渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心的王 明、张家涛、孙 彤*等人以水产品优势腐败菌——腐败希瓦氏菌为抗菌对象，选用丁香酚、丁香酚/麝香草酚、丁香酚/乳酸和丁香酚/溶菌酶（食品级和生物级）为保鲜剂，研究其抗菌性能及作用机制。采用抑菌圈法表征丁香酚及其复合保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抗菌性能，通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察菌体的微观形态变化，测定腐败希瓦氏菌菌体细胞膜的通透性、完整性、损伤程度以及菌体内Na＋、K＋-腺苷三磷酸酶（ATPase）和碱性磷酸酶（AKPase）活性变化，分析丁香酚及其保鲜剂的抗菌机制。
1、丁香酚复合保鲜剂抗菌性能分析结果
丁香酚复合保鲜剂对水产品优势腐败菌——腐败希瓦氏菌的抗菌性能如表1所示。丁香酚、麝香草酚、乳酸、食品级的溶菌酶作用于腐败希瓦氏菌后，均表现出较好的抑菌性能，而生物级别的溶菌酶无抑菌性能。与单一保鲜剂相比，丁香酚复合保鲜剂的抑菌性能更优。说明丁香酚与其他保鲜剂复配后，对腐败希瓦氏菌有协同抗菌作用。
2、丁香酚复合保鲜剂对腐败希瓦氏菌微观形态的影响
经丁香酚复合保鲜剂处理前后的腐败希瓦氏菌微观形貌如图1所示。对照组的腐败希瓦氏菌呈杆状，表面光滑且个体饱满，无形变损伤，菌体内部结构完整，细胞壁边缘较清晰，细胞膜包裹着细胞质，细胞质比较均匀地分布在细胞内（图1A1、A2）。由图1B1、B2可见，经丁香酚处理后，腐败希瓦氏菌稍有扭曲变形，菌体中间部位的细胞壁膜破损裂开、有明显凹陷。菌体内部的细胞壁膜变薄甚至消失，细胞质流失较多，菌体结构发生明显改变。分析认为，丁香酚可与细胞膜的磷脂反应，增加细胞膜通透性，使细胞出现孔洞甚至破裂，导致细胞内容物渗漏，使细胞死亡，这与Devi等的研究结果一致。由图1C1、C2可见，经丁香酚/麝香草酚处理后，腐败希瓦氏菌出现了质壁分离现象，细胞壁膜溶解，细胞质内容物分布不均，且有部分流失。分析认为，可能是麝香草酚中共同存在疏水性很强的苯环和亲水性较强的酚羟基，使其能够很快融入细菌的细胞膜中，因此，丁香酚与麝香草酚复配后可增加细胞膜通透性，使膜电位降低，细菌细胞膜上的离子通道被打开或被溶解损坏，细胞破裂，菌体内容物发生泄露。由图1D1、D2可见，经丁香酚/乳酸处理的腐败希瓦氏菌菌体出现褶皱、部分凹陷，细胞壁不完整，有溶解消失现象，造成细胞质内容物分布不均匀，饱满感缺失。丁香酚对腐败希瓦氏菌细胞膜能产生一定损伤，与乳酸复配后，未解离的乳酸更多地通过自由扩散进入细菌细胞膜内，在菌体内解离并释放质子，破坏细菌内部的酸碱平衡，进一步干扰细胞膜的正常代谢，从而对细菌的破坏进一步加强。
由图1E1、E2可见，经丁香酚/溶菌酶（食品级）处理后，腐败希瓦氏菌菌体细胞严重变形，褶皱加深，细胞部分萎缩，细胞壁膜损伤程度较重，造成内容物流出，密度下降，这是丁香酚与溶菌酶协同抗菌作用的结果。丁香酚首先与腐败希瓦氏菌细胞壁脂多糖层作用，使细胞壁肽聚糖层暴露，进而导致溶菌酶将暴露于表面的肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键水解，引起细胞裂解死亡。由图1F1、F2可见，经丁香酚/溶菌酶（生物级）处理后，腐败希瓦氏菌的菌体结构完全遭到破坏，细胞壁膜溶解严重，壁膜消失，细胞内容物严重流失，胞内物质向细胞膜一侧集中，并出现空腔。这可能是由于生物级溶菌酶比食品级溶菌酶纯度更高，活力更强。
3、丁香酚复合保鲜剂对腐败希瓦氏菌细胞膜通透性及完整性的影响
由图2A可知，随着保鲜剂对腐败希瓦氏菌处理时间的延长，菌悬液的电导率逐渐上升直至趋于平稳。经丁香酚复合保鲜剂处理后，菌悬液的电导率明显高于同期未处理样品。说明丁香酚提高了菌体细胞膜的通透性，导致菌体细胞内电解质泄漏。与单一丁香酚相比，经丁香酚/麝香草酚复合保鲜剂处理的腐败希瓦氏菌菌悬液的电导率略高，说明丁香酚与麝香草酚复配后，对腐败希瓦氏菌细胞膜流动性的破坏能力略有增强，加速了胞内电解质的流失，两者具有协同抗菌作用；而经丁香酚/乳酸复合保鲜剂处理后，腐败希瓦氏菌菌悬液电导率与单一丁香酚处理样品无明显差异。
由图2B可见，随着保鲜剂作用时间的延长，腐败希瓦氏菌菌悬液的吸光度逐渐上升。对照组菌悬液的吸光度上升较慢；经丁香酚处理初期，菌悬液的吸光度上升速率增加缓慢，而在200 min后，其上升速率加快，明显高于未处理的腐败希瓦氏菌，说明丁香酚对细菌细胞膜具有一定的破坏能力，但作用于菌体后不能立刻使细胞膜破坏，而作用一定时间后才能破坏菌体细胞膜，使细胞内DNA、RNA等大分子物质流出。采用丁香酚复合保鲜剂处理后，菌悬液的吸光度上升加快，其中丁香酚/溶菌酶（食品级）处理的菌悬液吸光度上升最快，丁香酚/溶菌酶（生物级）和丁香酚/麝香草酚次之，丁香酚/乳酸较慢，但高于单一丁香酚处理的样品，说明麝香草酚、溶菌酶和乳酸与丁香酚复配后对腐败希瓦氏菌细胞膜的破坏能力增强，具有协同破坏能力。经分析认为乳酸以未解离的有机酸分子形式通过自由扩散进入细菌，在细菌体内解离并释放出质子，降低了细菌内的pH值，破坏了细菌内部的酸碱平衡，造成菌体死亡。
4、丁香酚复合保鲜剂对腐败希瓦氏菌细胞膜损伤程度的影响
由图3A可见，经丁香酚处理后，腐败希瓦氏菌的外膜通透性增加。经丁香酚/麝香草酚和丁香酚/乳酸处理后，菌体的外膜通透性进一步增加，经丁香酚/溶菌酶（食品级）处理后，菌体的外膜通透性低于单一丁香酚处理的样品。而经丁香酚/溶菌酶（生物级）处理后，菌体的外膜通透性增加最显着。分析认为，麝香草酚、乳酸与丁香酚一样具有对细胞膜外膜的破坏能力，且与丁香酚复合后其破坏能力增强。此外，生物级溶菌酶在丁香酚作用后，对细胞膜外膜的破坏能力更强，两者具有协同增效作用。
由图3B可见，经丁香酚处理后，腐败希瓦氏菌的内膜被破坏。与丁香酚相比，丁香酚与麝香草酚或溶菌酶复配后，腐败希瓦氏菌的内膜损伤更严重，且丁香酚/麝香草酚对菌体细胞内膜的损伤程度最大。这是由于在麝香草酚的疏水性和亲水性基团共同作用下，对菌体细胞膜的内膜破坏能力更强，且二者发挥了协同增效作用。而丁香酚和溶菌酶在协同破坏细胞外膜之后，两者也会共同作用于细胞内膜，促进了菌体内膜的破坏。用丁香酚/乳酸处理后，对腐败希瓦氏菌内膜的破坏没有显着差异，这可能是由于丁香酚含量较少，且乳酸对细胞内膜无破坏能力。
5、丁香酚复合保鲜剂对腐败希瓦氏菌体内Na＋、K＋-ATPase和AKPase活力的影响
由图4A可见，经丁香酚处理后，腐败希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力显着降低，说明丁香酚能够降低菌体的Na＋、K＋-ATPase活力。与丁香酚相比，经丁香酚/麝香草酚和丁香酚/溶菌酶（食品级）处理后，腐败希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力显着提高，这可能是由于麝香草酚和食品级溶菌酶中的活性抗菌成分主要作用于细菌壁膜，而对菌体Na＋、K＋-ATPase的活性影响较小。经丁香酚/乳酸和丁香酚/溶菌酶（生物级）处理的腐败希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力远低于单一丁香酚处理的样品，说明乳酸进入细胞后可作用于Na＋、K＋-ATPase，使其活性降低。而生物级溶菌酶在丁香酚破坏细胞外膜脂多糖层后，与其协同破坏细胞膜其他组分，使菌体被严重破坏，菌体内的Na＋、K＋-ATPase失去正常发挥作用的环境，表现出Na＋、K＋-ATPase活力总体降低。
由图4B可见，经丁香酚处理的腐败希瓦氏菌AKPase活力显着降低，说明丁香酚能显着抑制菌体AKPase活性，这与仪淑敏的研究结果相似。分析认为，丁香酚在破坏菌体细胞壁膜后进入内环境，作用于AKPase，降低了AKPase活性，从而抑制了菌体的生长和代谢。与丁香酚相比，丁香酚复合保鲜剂对AKPase活性的抑制能力更强，说明麝香草酚、乳酸和溶菌酶菌与丁香酚存在协同效应，使其对AKPase活性的抑制能力增强。
结 论
丁香酚分别与麝香草酚、乳酸和溶菌酶复配后，对腐败希瓦氏菌均具有协同抗菌作用，使菌体结构损伤加剧。丁香酚及其复合保鲜剂对菌体的作用机制略有不同。丁香酚与溶菌酶（生物级）复配后，对细胞质膜的破坏能力最大。丁香酚与乳酸复配后，对Na＋、K＋-ATPase活力的抑制更加显着。丁香酚与不同级别溶菌酶复配后，可严重破坏细胞膜完整性，显着增加细胞膜通透性。而由于两种级别溶菌酶的纯度和酶活性存在差异，丁香酚/溶菌酶（生物级）复合保鲜剂可显着增加细菌内、外膜的通透性，且对Na＋、K＋-ATPase、AKPase活性的抑制作用最强，而丁香酚/溶菌酶（食品级）复合保鲜剂主要增加细胞内膜通透性，而对细胞外膜通透性的影响较弱。本实验研究了丁香酚复合保鲜剂对水产品优势腐败菌——腐败希瓦氏菌的抗菌性能，并阐明了其抗菌机理，可为提高丁香酚复合保鲜剂的性能并减少其使用量、降低生产成本提供参考。本研究结果可广泛应用于水产品保鲜方面，具有广阔的市场前景。
