《中国药典》2015版自出版发行已经过去2年，发布之初经过全国地毯式培训后，依然有很多地方有争议或者模糊，当时就有很多人问具体版的指南什么时间出版。
本月初，由国家药典委编制的《中国药典分析检测技术指南》终于出版发行，里面介绍了不少药典背后的故事，通读之后发现仍然有一些困惑点没说清楚。借此机会，结合本人自己的工作经验和理解，为大家带来这篇《1101 无菌检查法》困惑点释义，欢迎大家拍砖和指点！
1101 无菌检查法
药典导航丨《中国药典 第三部》2015版
位置丨通则76~通则80
分析检测技术指南导航丨P537 ~ P563
培养基相关
解读：《中国药典分析检测技术指南》提到FTM对于芽孢杆菌的培养有一定局限，但是FTM的主要贡献是可以在一般实验条件下实现厌氧菌的培养，随着厌氧培养设备的普及，FTM的优势很有可能在不久的将来被取代。从《胰酪胨大豆培养基和改良马丁培养基的微生物促生长能力考察》灵敏度考察部分可以看到对于霉菌的培养，改良马丁有数量上的优势。而TSB的优势是具有真菌和细菌（需氧菌）广谱的培养能力。
解读：密闭容器的理解，应该是无菌屏障的概念。从无菌保障时间来说，工业化生产的盐水瓶包装的生理盐水和无菌氯化钠缓冲液可以达到一年的有效期。从培养基营养的角度来说，工业化生产的预制平板一般可以在2-8℃保存3个月。但是，在一般实验室水平，根本达不到密闭容器的条件，即使是手工压盖的盐水瓶。如果非要验证一下有效期，拿琼脂平板来举例，建议固定一下分装及包装流程，然后通过适用性检查来检验。另外，琼脂平板的保存要点是不能到0度以下（培养箱波动大的一定要注意，2-8℃可以看成5±3℃）和水汽的控制。对于灭菌F0≥8或者过度灭菌的培养基才有有效期验证的必要，对于115℃灭菌或者煮沸灭菌的培养基还是建议现配现用。
解读：FTM氧化层的控制，关键是装量的控制和密封的程度。在USP40中提到了面积/深度比的概念。适用性检查中提到的12ml装量也要看一下你用的是什么管径的试管，推荐使用如下图的加盖试管，内部还有垫片。密封程度较好。
解读：这个培养基出现在硫酸链霉素和硫酸卡那霉素的各论中，采用的是直接接种法，且按照该法无法通过药典的适用性检查。在2020版药典修订中，上海食品药品检验所已经建议删除该培养基。
解读：根据GB 2828.1-2012计数抽样检验程序查表可得，随机取样5支全部合格的批量指示为一般检验水平9-90。如果配制数量比较大的话，建议加大抽样量。
菌种相关
解读：新鲜培养物应该理解为在指数期生长的微生物，一般在静置培养条件下细菌经过转接8-12小时可以达到指数期，此时细菌的活力最大。而对于可以产生孢子的微生物来说，建议直接保存孢子使用。《枯草芽孢杆菌孢子悬液保藏期的验证》研究表明4℃和25℃保存1个月内枯草芽孢杆菌孢子悬液菌落计数结果稳定。《黑曲霉孢子悬液贮存期的验证》研究表明4℃保存6个月内黑曲霉孢子悬液菌落计数结果稳定。
方法适用性试验相关
无菌检查方法学开发决策树
解读：上图是我自己绘制的决策树，方便大家在方法学开发的时候整理思路，仅供参考，其中，大家问的比较多的困扰点是关于“如何去除样品中的抑菌性”和“样品的前处理”，下面我整理下我的看法。
去除抑菌性的常用手段
1. 首选合适的中和剂
中和剂包括药典中推荐的化学中和剂和酶类，用了适合的中和剂可以提高方法的可重复性（拿冲洗来举例，你冲洗和他冲洗或者这次冲洗和那次冲洗，确实差的很多），同时也能减小工作量。
药典中有常见中和剂的列表，也可以参考大型制药企业和药检机构发表的学术文章（用谷歌学术搜索或者百度学术搜索）。国外原研药的无菌检查方法也可以参考，但是很有可能因为溶解性的不同，去除抑菌性的效果相差太多。
2. 提高药品的溶解性，减小滤膜与药品的接触，减少残留
提高药品的溶解性，使用适合的溶解缓冲液，梯度溶解或者使用无菌助溶剂。这里的无菌助溶剂是我一厢情愿的想法，甚至提出了“检验研发”的概念。与业内人士了解后才知道，由于原料质量的差别和生产过程的精细控制不到位，有些抗生素的溶解性先天就不好。但是适当的延长溶解时间还是很有效果的。
高泵速进样，边进边出。
提前润洗滤膜，不要小瞧这步，有研究表明提前润洗后残留量可以相差3倍。
选择残留比较小的滤膜材质。
提高样品的稀释倍数。
3. 提高冲洗效率
少量多次冲洗（有些厂家每次冲洗量最少在30-50ml），达到梯度效果。据我所知，国内很多抗生素的厂家的验证资料都是用的少量多次。不过在《中国药典分析检测技术指南》2017年版中提到要模仿USP40中的100ml每次，不过总冲洗量还是控制在1000ml以内没有靠拢USP40中的500ml。国内很多产品如果不能找到其他方法，就只能分膜了。
注意前1-2次的内壁清洗（尤其是样品流经的区域）。
冲洗过程中降低泵速。
每次冲洗都要尽量冲洗干净，管路中也要注意。
前处理常用手段
1. 乳化
乳化是一种液体以极微小液滴均匀地分散在互不相溶的另一种液体中的作用。乳化的操作顺序特别重要，有些样品需要先分散在稀释液中再加入乳化剂，而有些样品需要先分散在乳化剂中再加入稀释液，可能与样品中的辅料组成有关，建议同时尝试操作。其次是温度。温度越高越好乳化，但是由于无菌检查要求适当加热最高不得超过44度。操作时要注意样品制备液和稀释液及冲洗液的温度差，如果稀释液及冲洗液太冷，刚刚乳化的样品就会凝固。
2. 萃取
使用十四烷酸异丙酯萃取掉样品中的辅料。在微生物限度检查中，还有另一个用法可以萃取掉可溶于酯类的抑菌成分，这是后话以后再说。
