在一定浓度的琼脂糖凝胶中，DNA片段迁移距离和其含有的碱基对数量成反比，因此可以通过与标准条带迁移距离进行比较，由此得出目的条带的大小，但这仅对双链线性的DNA比较准确（DNA Marker一般为双链线状DNA），且对大于20kb的DNA不适用（普通琼脂糖凝胶很难将其分开）。
2、核酸分子构像
DNA分子在电场中的迁移速度不仅和分子量有关，还和它本身的构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中的移动速度不一样，移动速度次序为：共价闭环DNA>线性DNA>开环DNA。当琼脂糖浓度太大时，环状的DNA一般不能进入胶内（停留在孔中）。
3、琼脂糖浓度
同样的线状DNA分子在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，DNA电泳迁移率的对数和琼脂糖凝胶浓度呈线性关系，凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
4、电源电压
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率和所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分离率达到最大，所使用的电压不得超过5V/cm。
5、电泳方式
用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。垂直型电泳，一般用聚丙烯酰胺凝胶做为支撑物。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。
6、嵌入燃料的存在
常用的荧光染料EB可以嵌入到堆积的碱基对之间，使其刚性更强，并使其迁移速率有所下降。
7、电泳缓冲液的离子强度
电泳缓冲液的组成和离子强度也能影响DNA的迁移速度。在离子存在很少的情况下（如无用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误用10×电泳缓冲液），则电导率很高并产热明显，严重时能引起凝胶融化或DNA变性。
