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多肽合成技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-02-21
核心提示:多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程,固相合成顺序一般从C端(羧基端)向 N端(氨基端)合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来,经过不断的改进和完善,到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术,表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。
   多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程,固相合成顺序一般从C端(羧基端)向 N端(氨基端)合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来,经过不断的改进和完善,到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术,表现出了经典液相合成法无法比拟的优点,从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。多肽合成总的来说分成两种:固相合成和液相多肽合成。
 
  多肽是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质,它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间,是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质的总称,常常被应用于功能分析、抗体研究、尤其是药物研发等领域。
 
  多肽合成服务包括标准化学多肽合成、多肽修饰、多肽文库以及重组多肽表达。逐步固相多肽合成能合成5-50aa的多肽,对于大于200aa的多肽,通过片段浓缩及连接技术来合成。
 
  固相合成
 
  1963年,Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS),由于其合成方便,迅速,成为多肽合成的首选方法,而且带来了多肽有机合成上的一次革命,并成为了一支独立的学科——固相有机合成,固相合成的发明同时促进了肽合成的自动化。世界上第一台真正意义上的多肽合成仪出现在1980年代初期。
 
  液相合成
 
  基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上,合成一步步地进行,通常从合成链的C端氨基酸开始,接着的单个氨基酸的连接通过用DCC,混合炭酐,或N-carboxy酐方法实现。Carbodiimide方法包括用DCC做连接剂连接N-和C-保护氨基酸。重要的是,这种连接试剂促接N保护氨基酸自己炭基和C保护氨基酸自由氨基间的缩水,形成肽链,同时产出N,N?/FONT>-dyaylcohercylurea副产物。 然而,此方法因其导致消旋的副反应,或在强碱存在时形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影响。庆幸地是,这些副反应能最小化,但是还不能完全消除。方法是加入象HoSu或HoBT这样的连接催化剂,此外,此方法也可用于合成N保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与任何别的C保护氨基酸或肽反应形成新的肽。
 
  多肽合成仪  多肽合成仪是指用来合成多肽的仪器,因为多肽合成的步骤很繁琐,又很耗时,多家公司开发了自动多肽合成仪。一般分为两类,一类是针对数量少但合成量大的生产型应用,典型代表是美国ABI公司的ABI336型多肽合成仪,其反应器转动方式有别于前两代的多肽合成仪,即反应器上方相对固定,而下方作圆周360度快速旋转,带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动,一直达到反应器的最上方;另外一类多肽合成仪针对于药物研发、基因研究等科研性应用,典型代表是德国Intavis AG公司的ResPep SL和MultiPep RS系列,可以同时提供固相合成和膜合成的应用,并能自动帮助客户进行图谱筛选同时完成高通量的多肽合成工作。
 
  运行原理
 
  多肽合成仪以固相合成为反应原理,在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知顺序(序列,一般从C端-羧基端 向 N端-氨基端)不断添加、反应、合成,操作最终得到多肽载体。固相合成法,大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生,参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的,并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种,即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势,现在大多采用Fmoc法合成,但对于某些短肽,tBoc因其产率高的优势仍然被很多企业所采用。
 
  具体合成由下列几个循环组成:
 
  1) 去保护:Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去 除氨基的保护基团。
 
  2)激活和交联:下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联,形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环:这两步反应反复循环直到合成完成。
 
  3) 洗脱和脱保护:多肽从柱上洗脱下来,其保护基团被一种脱保护剂(TFA) 洗脱和脱保护。
 
  基本元件
 
  反应器
 
  数百年来,制药业的反应器/反应釜设备以玻璃材质最为常见,因其完全透明且耐腐蚀,而被众多化学、生物学专家沿用。多肽合成的过程需要操作人员直观监测,同时合成后可进行在线切割(切割试剂TFA的强腐蚀性对反应器材质有了极大限制),这些要求限制反应器以玻璃材质最为适用。
 
  玻璃材质的反应器在制造工艺上有极大的难度限制:①烧制工艺:磨口精度要求极高,正如很多国产设备都无法达到要求出现漏液漏气现象,玻璃壁均匀程度等。②配合搅拌柄以及密封装置的成套加工工艺③防爆处理
 
  氨基酸储罐
 
  溶剂储罐
 
  量筒   转液瓶
 
  感应器
 
  多端触发器自感应定量量取法,直观、科学、相对误差最低。
 
  废液桶
 
  废液桶通常选择容积较大的HDPE桶,保证通风良好,同时需安装感应器装置时刻检测废液情况,避免溢出。
 
  控制配件
 
  电磁阀
 
  多肽合成仪中的电磁阀属于敏感配件,其控制液路的串联与闭路,在氨基酸转移与量取,溶剂转移与量取两步骤中起到至关重要的作用。不同品牌的合成仪对电磁阀的设计与排布也略有不同。
 
  控制面板
 
  控制面板内往往含有光敏组建,部分控制电磁阀以及感应器控制组。与电脑主机的控制系统、合成仪统一的链接在一起,完成多肽合成的全过程。
 
  软件系统
 
  多肽合成仪的操作软件。不同品牌合成仪所注册的软件也不同。
 
 
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