推荐引物设计得比一般稍长一点（24–35 bases），解链温度稍高一点（65 °C以上），并且GC含量控制在50–60%。当然除此以外，PCR引物设计的标准规则是肯定要遵守的：保持几对引物解链温度相似、避免互补序列、避免3’端出现超过3个连续的G或C，以及以及验证、验证、再验证。
多重定量PCR不能用SYBR Green等插入染料，探针法是唯一的选择，例如Life Tech公司的TaqMan?探针或者IDT公司的PrimeTime? 探针。Bio-Rad公司的经理Keith Cockrum建议将这些探针的解链温度设计得比扩增引物的高7–8 °C。
原则一B：引物验证
引物验证必不可少的步骤，首先将每对引物分别在模板上进行测试，这里的模板指对照样本，例如安捷伦公司的QPCR Reference Total RNA。可用SYBR Green熔解曲线分析引物对是否扩增出单一产物。另外还要引入温度梯度，以确定所有引物都能起作用的温度范围。如果有一对引物不能与其他引物一同起作用，建议直接放弃这对引物重新开始设计。
如果要做多重定量PCR，建议先在单重反应中测试探针，用一系列稀释度来确定每个探针的动态区域。最后再把所有元素组合到一起，确保各自的特异性、敏感性、动态区域等没有受到影响。
原则二：引物浓度
第二项原则是，保证每个引物浓度都低于单重PCR中的浓度，否则“反应中的总引物浓度会就会太高”。传统PCR反应中引物浓度为0.2 μM，那么我们可以试试0.15 μM（引物浓度范围通常在0.05 μM至0.4 μM之间）。
原则三、四、五：优化dNTP、MgCl2、聚合酶和盐的浓度
一般多重PCR需要更多的dNTP、镁离子和聚合酶。推荐使用0.3 mM dNTP（而非标准的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反应体系5 units聚合酶（而非1.25 units）。最后再试试盐浓度，“在优化的时候，增加盐总会有帮助，尤其能增加特异性。
PCR master mix含有缓冲液、盐、dNTP、Mg和聚合酶，如果使用常规1.25× 或1.5×的PCR mastermix就已经差不多做到了上述原则的三至五。另外，您还可以选用转为多重PCR优化的产品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ? Multiplex Powermix、或者安捷伦的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。
