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参照菌株的获取、活化与确认

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-11-08
核心提示:实验室为了进行检验质量控制、检验方法的验证、确认灭菌效果、培养基或其他生物试剂性能确认等方面的工作,都需要用到一定量的标准菌株。
   实验室为了进行检验质量控制、检验方法的验证、确认灭菌效果、培养基或其他生物试剂性能确认等方面的工作,都需要用到一定量的标准菌株。按照中国实验室国家认可委员会指定的检测和校准实验室认可准则(CNAL/AC01)中关于标准物质的规定,微生物标准物质应严格其保存、使用、管理及确认程序。微生物标准菌株的保存、使用和管理是食品微生物实验室的一项重要工作。
 
  获取
 
  实验室标准菌株可以通过购买、交换、接受赠送等途径获得。实验室自行分离的菌株对图标准菌株经过鉴定后,可以做为参考菌株(参考培养物, reference cultures)在实验室内使用。
 
  标准菌株的源头是专门的菌种保藏机构的菌株,如ATCC (American Type Culture Collection美国典型培养物保藏中心)的菌株、其他国外权威菌种保藏机构或我国国家菌种库储存的各级标准菌株等。
 
  需要注意,商业来源的菌株是演化菌株(派生菌株),并不是原代菌株,例如:商业ATCC菌株都是派生菌株。保藏中心提供的菌都有固定的编号(菌株号)。
 
  通常菌株编号由两部分组成:前面是几个字母的缩写代表菌种保藏机构,后面紧跟一串数字表明其编号。
 
  活化
 
  从菌种保藏中心购买的菌种一般是安瓿瓶装的冻干粉剂,近来又出现了几种新的菌种保藏方式,如: MAST CRYOBANK菌种保藏管、LyfoCults Plus菌种保藏系统、Culti -Loops菌种保藏系统等。
 
  参照随附的菌种使用活化方法进行活化。商品化的保藏菌株须按照厂商的说明进行,对于有特殊条件要求的菌株尤其要按照推荐的方法执行。
 
  根据GB 19489 《实验室生物安全通用要求规定》,病原微生物分为I级~N级危害等级。实验室在符合相应生物安全水平的条件下,进行菌种活化,一定要做好防护。食品微生物实验室一般只需储存危害等级I、II级的微生物,高危害等级的微生物不应在食品微生物实验室保存。
 
  (一)外包装的开启
 
  从保藏中心购买的菌株通常有三层包装。内层(如安瓿瓶)是用于盛放微生物,完全密闭,外面用吸水材料包裹,泄漏时起吸附作用。中间层是用塑料罐、泡沫塑料等制成的,对内层起支撑保护作用,该层可以装数个内层容器,两者之间有填充填料。外层是硬纸板箱、木箱、塑料箱等制成的,用于保护内包装。
 
  包装开启先要根据菌种所需的防护水平,穿防护服,带好手套、口罩、帽子,然后检查菌种包装外观,仔细看有无渗漏、破损等异常现象。检查无异常后将外包装除去,依次检查中间层、内层,直至完全打开。
 
  若发现内外层包装都有破损渗漏现象,并且安瓿瓶等微生物容器已经破损,要立刻通知有关部门和菌种发放单位,对包装、运输工具等微生物污染物进行消毒。若外包装有破损等异常情况,但安瓿瓶等微生物容器无破损,或安瓿瓶等微生物容器已破损,但外包装无破损、渗漏情况,则无需溯源。对安瓿瓶等微生物容器无破损,按要求开启;对安瓿瓶等微生物容器已破损,可按照生物安全操作原则,对微生物污染物进行消毒灭菌处理。
 
  (二)安瓶瓶的开启及菌种复活
 
  检查完好无损的安瓶瓶可以开启,一般按下面方法打开内层包装,取菌种。
 
  单瓶安瓶瓶(见图1),先用75%酒精棉擦拭安瓶瓶上部,再用砂轮在安瓿瓶上部横向锉一道痕迹,然后将划痕处向外,用无菌脱脂棉包住安瓿瓶(保护双手),手持安瓿瓶从锉痕处稍向外用力打开安瓶瓶。还可采用将安瓿管顶部烧热,滴上几滴无菌冷水或用无菌棉签沾冷水在顶部擦一擦,顶部出现裂纹,用消毒镊子轻叩一下,敲下安瓿管的顶端。
 
  双瓶安剖瓶(见图2)先把外瓶的顶端烧热,再在顶端滴几滴冷水,使顶端玻璃出现裂纹,用镊子等敲掉顶端,最后用消毒镊子取出绝缘层和闪瓶。
 
  选择合适的培养基和培养条件(根据生产商说明)进行复活。冻干菌株的传代次数不得超过5代,从菌种保藏中心购买的冻干菌种为第0代。
 
  细菌的复活方法:用无菌吸管(或移液器)吸0.5 mL液体培养基加到冻干菌块上,吹打制成菌悬液。将全部菌悬液移入5ml合适的肉汤培养基中。将管中残留的几滴悬液移种到斜面上。在合适的条件下培养,细菌培养温度通常为25℃或37℃。多数冻干菌株会在几天后长出,但是少数菌会表现出延滞期延长的现象,需要将正常培养时间加倍。
 
  霉菌和酵母菌的复活方法:用无菌吸管(或移液器)吸0.5 ml-1 ml无菌水到冻干菌块上,将全部内容物移入装有5mL无菌水的试管中进行复水,2h (或过夜)后接种到肉汤或固体琼脂上,在合适的温度下培养,真菌培养温度通常是25℃。少数培养物会表现出延滞期延长的现象,需要将正常培养时间加倍。如菌株在推荐的条件下培养不生长,须灭菌处理之后方可丢弃。
 
  (三) MAST CRYOBANK菌种保藏管的使用
 
  MAST CRYOBANK菌种保藏管是由冰冻小管组成的多功能保藏系统,每支小管中包含20-25粒覆有特殊低温防腐溶液且经过化学处理的珠子。菌种保藏时,只需将经纯化培养培养生长旺盛的菌株接入保藏管溶液中,通常需要4~7环,苛养菌要多接一些,拧紧盖子充分震荡,细菌即吸附在小珠子上,再用无菌吸管吸走溶液,放入冰箱保藏, -70℃可保存10年,-15 ℃~-10℃可保存1年~3年。
 
  菌种的活化只需将小珠放在合适的琼脂平板上滚动或置于肉汤中培养即可。
 
  (四) LyfoCcults Plus菌种保藏系统
 
  LyfoCcults Plus菌种保藏系统是一个集储存、复溶和接种于一体的系统。形状像钢笔,使用方便。使用时只需撕开铝箔袋,取出LyfoCults Plus装置,旋开一端,取出接种棒,用力挤捏另一端的塑料安剖瓶的液体,混匀后流入带干粉状菌小管中,用接种棒在小管中搅动,使菌复溶形成菌悬液,用接种棒蘸两滴菌液接种到培养基上,涂抹均匀后进行培养复苏。
 
  LyfoCults Plus菌种保藏系统的使用见图3。
 
  (1)从箔片包装上揭下预先打印好的标签,贴在要接种的培养基上。
 
  (3)撕开安全密封条。
 
  (4)旋开小管上的敷抹器,打开系统。
 
  (5)用力挤压安瓿瓶,使所有的液体化合物倒进小管中。
 
  (6)混匀。
 
  (7)把小管的顶部作为移液管,在培养基上滴两滴菌悬液。
 
  (8)用小管的尖端在培养基上划线。
 
  L,yfoCults Plus菌种保藏系统的使用
 
  (五) Culti-Loops菌种保藏系统
 
  Culti-Loops菌种保藏系统是一种接种环形式的菌种保藏系统,接种环上有少量的菌,无需制备,可直接在平板上划线进行活化,每个接种环可接5块平板。此保藏系统除弯曲菌需冷冻保存(-18℃)外,其他只需2℃~8℃保存。
 
  (六)实验室其他方法保藏菌株的复活
 
  实验室内采用其他方法保藏的菌种复活时可按不同的方法。如在超低温冰箱中的菌种,复活时,只需取出冷冻菌种的小管,在室温下融化后接种在适宜的培养基中培养即可。液体石蜡法、沙土管保藏法、半固体穿刺保藏法保藏的,用接种环挑取即可。
 
  确认
 
  菌种确认可从菌落形态,细胞形态,芽孢大小、位置、形状,生化鉴定等方面进行。
 
  (一)菌落形态
 
  取复活后的菌,在相应的鉴别平板或普通非选择性平板上划线分离,培养出单菌落,观察菌落形态是否符合,同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似;对于出现两种或以上形态的菌株,应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养,检测是否重复出现相同特征。
 
  (二)细胞形态
 
  对数生长期的培养物革兰氏等染色反应应呈现一致性,细胞形状、大小、鞭毛、荚膜等特征应相似。
 
  (三)芽孢
 
  形成芽孢的菌种,其芽孢大小、位置、形状应相似。
 
  (四)生化鉴定
 
  必要时进行生化鉴定等实验,进一步确认。
 
  在菌种确认过程中,如发现菌种有污染,则要分离挑选目标菌株,培养成功后将污染培养物高压灭菌处理。
 
 
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