草莓、树莓、蓝莓等小浆果被誉为“第三代”水果，因含有丰富的保健营养成分，受到广大消费者的青睐。但是，随着全球小浆果消费量的持续增长，新鲜和冷冻小浆果中与食源性HAV和NoV有关的感染事件也在逐年上升。
为确保小浆果类食品的安全，辽宁大学生命科学院的冯华炜、艾海新和刘宏生*等人拟从以下3 个方面进行综述：1）调查食源性HAV和NoV在小浆果中的流行状况，为甲型肝炎和腹泻性疾病的爆发预警提供数据；2）提出食源性HAV和NoV的提取和核酸检测方法的最新知识，为完善食源性HAV和NoV的检测方法提供思路；3）阐述检测过程控制在食源性病毒检测中的应用情况，为准确评估检测结果、合理解释检测数据提供帮助。
1.与小浆果有关的HAV和NoV的流行状况
大量的研究表明，小浆果已成为传播食源性病毒的重要媒介，其中食源性NoV和HAV为污染小浆果的两种重要病原菌。
由于HAV和NoV在冷冻后仍具有完整基因和结构，因此在所有受污染的小浆果产品中，冷冻类型的浆果成为潜在的高风险食物。在所有污染的食物中，小浆果混合食物（如含小浆果的沙拉或甜点）占主要位置，其次为小浆果单独引起的污染。
2.小浆果中食源性病毒的检测方法
2.1 病毒提取方法
2.1.1 病毒洗脱-浓缩法
在食源性病毒的提取方法中，基于病毒洗脱-浓缩的方法在小浆果中得到广泛应用，其中碱性洗脱结合聚乙二醇（PEG）沉淀的方法应用最广。病毒洗脱-浓缩法主要包括两个关键步骤：1）从食品基质中洗脱释放病毒；2）从洗脱液中浓缩病毒。
完整的病毒洗脱是保证病毒颗粒完整提取的重要基础。在小浆果样品的病毒洗脱过程中，大量果胶的存在会抑制小浆果样品中病毒的提取效率。有研究指出，食品表面产生的气泡有助于病毒粒子在食品表面进行充分释放，进而提高病毒的洗脱效率。研究表明，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可有效去除小浆果中的多酚物质。洗脱后的病毒颗粒存在于大体积的洗脱液中，对病毒滤液进行浓缩以获得高浓度、高纯度的完整病毒颗粒对于之后的核酸提取极其重要。从总体来看，具有高亲水性的高分子聚合物PEG，可以通过吸收洗脱液中的水分来减少病毒之间的距离，对食源性病毒具有更好的浓缩效果。但在食源性病毒提取过程中，PEG沉淀法会产生许多与病毒无关的小分子物质沉淀，对聚合酶链式反应（PCR）产生强烈的抑制效应。
2.1.2 直接提取病毒法
目前，直接向小浆果样品表面添加裂解液的病毒提取方法得到了一定应用，具体步骤为：1）样品中添加裂解液，室温孵育5min；2）室温条件下15000×g离心5 min，提取病毒RNA。该法操作步骤简单，将病毒提取时间缩短了15 倍，具有很好的病毒提取效率。
2.2 病毒检测方法
2.2.1 RT-PCR方法
采用非特异性的置入染料或者特异性探针在“实时”方式下检测病毒RNA的实时反转录PCR（RT-PCR）法是食源性HAV和NoV检测的“金标准”。在食源性HAV的检测过程中，高度保守的5’NCRs是设计HAV引物探针的理想区域（图4）。开放式阅读框(ORF)1-ORF2连接区域是NoV最保守的区域，对NoV所有的基因型具有高水平的核酸序列一致性（图5），这个特征使得(ORF)1-ORF2成为设计NoV实时RT-PCR引物的理想区域。实时监测和修订实时RT-PCR中的引物探针极其重要。
在单重定量RT-PCR（RT-qPCR）法中，一个样本在检测不同的病毒时，检测所需的核酸量取决于待检病毒的种类，检测效率较低，不适用于检测食源性疾病爆发中的稀有样品。在同一反应管中进行多重病毒检测的多重实时RT-PCR检测技术（MRT-PCR）的应用进一步提高了病毒的检测效率，与单重RT-qPCR相比，MRT-PCR可缩短50%的检测时间，显着降低试剂耗材费用。但是受PCR荧光检测通道的影响，病毒在MRT-PCR扩增过程中会产生相互抑制作用。为了解决这种缺陷，微流体定量PCR（MFQPCR）技术进一步得以发展。在MFQPCR技术中，一个芯片上可以同时进行多个纳升级（10-12 L）的qPCR。目前，MFQPCR技术在食源性肠道病毒的高通量检测与分型中得以应用，在小浆果的食源性病毒调查中应用较少。
2.2.2 数字PCR方法
基于相对基因组定量的RT-qPCR方法需要采用标准品（DNA或RNA）进行校准，定量结果容易产生偏差，对弱阳性样本（Ct值≥40）难以进行定量，且存在严重的RT-PCR抑制效应。采用微量核酸直接测定基因拷贝数的数字RT-PCR（dRT-PCR）技术可以解决这一缺陷。dRT-PCR方法通过将样本（微升体积）稀释分配到微流体芯片或微液滴中，采用与RT-qPCR相同的引物和探针进行大量单独的荧光PCR扩增，使得每个反应中包含1 个或0 个目标核酸拷贝数，最后通过泊松分布计算原始样本中核酸的拷贝数。由于dRT-PCR是在RT-PCR终点进行阳性扩增的计数统计，对小浆果中的RT-PCR抑制物具有更高的耐受性。此外，dRT-PCR具有较高的检测灵敏度，在草莓样品中NoV的检测限为185 拷贝数/25 g，高于RT-qPCR法的257 拷贝数/25 g。在检测低水平拷贝数样品时精确度和重复性更优，适用于混合感染小浆果食物及其加工制品中的食源性病毒检测，但是dRT-PCR法的最低检测限在低污染小浆果中的实际应用价值尚需进一步验证。
2.2.3 下一代测序技术
利用下一代测序技术（NGS）对病毒的宏基因组进行分析，不仅有利于对食源性致病菌达到分子水平上的整体深入认识，同时也给食源性病毒的快速检测提供了更灵敏、更特异的技术可能。NGS以一种大规模并行的方式将这个过程扩展到数百万个反应中，实现了病毒全基因组的高通量快速测序。在合适的测序深度下（食源性病毒基因组较小，测序结果中注释到病毒的序列较少，所需测序深度可达上百倍），NGS可以完成食品样品中常见和罕见的NoV变异序列的分析。NGS技术还具有很高的灵敏度，可以从人工污染的芹菜检测出低于103 拷贝数的HAV和NoV。作为一种无目标的方法，NGS技术可用于食源性疾病爆发事件的污染源调查。目前的研究表明，测序过程中产生大量与植物相关的序列（87.06%）使得与病毒相关的序列（0.01%）相对较少，是目前限制NGS用于小浆果中食源性病毒检测的障碍。
3. 检测过程控制
基于PCR的方法在食源性病毒的检测中分为3 个步骤：1）病毒提取；2）病毒RNA提取；3）RT-PCR检测。在病毒检测过程中，抑制效应发生于各个检测阶段。首先，食品样品基质中存在大量的RT-PCR抑制物会影响食源性病毒的有效提取；其次，病毒RNA提取过程中提取试剂、食品基质成分的残留同样会对RT-PCR产生抑制作用；最后，RT-PCR检测中，RNA提取试剂的残留、引物探针和酶的质量也会影响病毒的扩增效率。依据添加位置的不同，过程控制被分为3 个类型（图6）：1）全程过程控制（WPCs）：在病毒提取前加入；2）分子过程控制（MPCs）：在核酸提取前加入；3）RT-PCR控制：在RT-PCR扩增前加入。另外，过程控制的提取效率需满足一定的水平，通常将病毒RNA的提取效率分为3 个水平：低（小于1%）、可接受（1%～10%）和良好（超过10%）。当RNA提取效率小于1%时，需重新进行病毒富集或病毒RNA的提取。
3.1 全程过程控制
接种于样品中的过程控制是一个典型的WPCs。可培养的病毒颗粒是评估食源性病毒提取效率的理想WPCs，这些病毒与待检目标病毒具有相似的形态、遗传、环境持久性，更不会出现在待检的污染样品中。WPCs在食源性HAV和NoV检测中的应用研究显示，WPCs和目标病毒的相关性主要取决于食品基质的类型。同一WPCs在不同类型的食品中也具有不同的回收率。此外，病毒提取过程中发生的大量损失也是影响WPCs回收率的主要原因之一。不同WPCs的损失位置也有很大差异。在指示目标病毒的提取效率时，WPCs的加入量应大于或等于WPCs在待检样品中的检测限。
3.2 分子过程控制
WPCs的指示效率容易受下游操作的影响，从而导致同一WPCs在相同的样品中表现出不同的提取效率，因此针对不同检测阶段采取不同的过程控制极为重要。在提取好的病毒沉淀或溶液中加入一定量的MPCs进行共同提取，可以有效指示病毒RNA提取过程中发生的抑制效应。WPCs的添加量需进行准确评估，含量过高会抑制目标病毒，含量过低会降低检测限。在实际检测工作中，需针对不同类型的食品基质，采用不同的MPCs进行核酸提取效率的监控。
3.3 RT-PCR过程控制
当RT-PCR过程控制的抑制指数小于2.0时，表明WPCs具有良好的提取效率，也表明RT-PCR扩增效果良好。在食源性病毒的检测中，各种类型的DNA或RNA可以作为RT-PCR过程控制。但是，当反应体系中存在抑制物质时，过程控制和目标病毒在同一反应管的扩增效率就很难准确计算。此外，使用该类RT-PCR控制容易引起待检核酸样品的污染，导致“假阳性”检测结果的产生。此外，在PCR反应体系中加入外部扩增控制也可以指示RT-PCR的抑制效应。该类过程控制与目的基因序列共用同一对扩增引物，通过扩增产物大小或荧光标记与靶病毒进行区分，避免了在PCR反应体系中多对引物间的相互作用，可用小浆果样品中病毒RT-PCR抑制效应的监测。
结 语
食源性HAV和NoV引发的小浆果产品感染已成为全球重要的公共卫生问题之一，而且已经有愈演愈烈的趋势。小浆果产品中食源性病毒的快速检测仍然面临巨大的挑战。建立可靠的采样标准和检测方法是解决污染小浆果产品农产品中低剂量HAV和NoV不均匀分布的问题的有效途径。
在食源性HAV和NoV的检测中，病毒提取、核酸检测和检测过程控制是三大关键因素。在病毒提取中，洗脱-浓缩法成为常规提取方法，在洗脱缓冲液中加入PVP、果胶酶等物质可以减少食品基质效应的影响，利用食品表面产生的气泡充分释放吸附于食品表面的病毒颗粒，采用直接提取病毒RNA法在特定浆果中也有一定应用，但是如何尽可能地去除提取过程中产生的抑制物质、完善病毒提取方法的适用性仍然面临挑战。在核酸检测方面，基于PCR的方法是食源性病毒检测的“金标准”，其中，单重RT-qPCR和MRT-qPCR方法检测效率低，不适用于大样本的检测；MFQPCR可以实现小浆果产品中食源性病毒的高通量检测与分型，但是尽可能地去除PCR抑制物质仍然是研究人员需要努力的方向；绝对定量的数字PCR技术对抑制物的耐受性强于RT-qPCR方法，具有很高的灵敏度，适用于高抑制剂食物的无标定量检测，但是该法的最低检测限在弱阳性小浆果样本中的实际应用价值还需进一步验证；采用NGS技术对病毒宏基因组进行分析，不但可以实现未知病毒的定量检测与分型，还可以判断病毒的感染性，已在NoV的病毒学监测和环境监测中得到一定应用，是最有前景的食源性病毒分析方法之一，但是有效去除干扰序列是下一步所期待解决的问题。在检测过程中评估病毒回收率的过程控制可分为3 种类型：WPCs、MPCs和RT-PCR控制，也有各种类型的过程控制应用于各个检测阶段，但迄今为止还未建立既可用于控制又能保持适当回收率的过程控制“金标准”；其次，在评估检测过程的整体性能时，不仅需要考虑单个样本的回收率，更要考虑样本的平均回收率，才可以实现检测数据的准确解释；最后，利用装甲RNA技术构建非致病性的病毒样颗粒可以对病毒的检测效率进行指示，但在实际检测过程中，仍需考虑病毒样颗粒对目标病毒的适用性。
源头控制是食源性疾病防控的一个重要手段，通过建立可靠的采样标准和良好的检测方法，可以快速溯源爆发中可疑的污染源。此外，建立小浆果食源性HAV和NoV爆发数据库，利用大数据分析方法建立食源性HAV和NoV爆发预测模型，从时间、空间、生产链等方面对小浆果产品中可能发生的食源性病毒感染进行精准预测，进而从源头上防控食源性HAV和NoV病毒的爆发和感染。
