传统的配方奶粉及配方乳为了保证产品的安全性必须进行较高温度的热处理，从而导致蛋白质变性、维生素损失等问题，并会产生一些美拉德反应产物。热处理对乳铁蛋白的结构、铁结合能力、抑菌功能、促成骨细胞增殖和分化功能的影响是目前研究的热点。但至今对巴氏杀菌后乳铁蛋白影响肠道免疫的机制，特别是肠细胞增殖方面的探讨仍鲜见报道。
因此，东北农业大学食品学院的席恩泽、赵晓和许晓曦*等人旨在探讨乳铁蛋白在常见巴氏杀菌条件下被婴儿胃肠液进一步水解后的免疫功能，并进一步探究乳铁蛋白对肠道免疫的作用机制。以期为乳铁蛋白作为营养添加剂在婴儿配方食品中的应用提供理论依据。
巴氏杀菌后的牛源乳铁蛋白水解液对IEC-6细胞增殖的影响
实验初期质量浓度选定范围为0～1 mg/mL中几个关键点质量浓度。结果显示细胞增殖率以0.1 mg/mL为分界线，当质量浓度小于0.1 mg/mL时细胞增殖率逐渐增大；当质量浓度大于0.1 mg/mL时细胞增殖率呈现降低趋势。最终选定最佳质量浓度范围为0～0.1 mg/mL内几个关键点质量浓度进行实验，并计算分别培养24、48 h时的细胞增殖率，结果显示，随着乳铁蛋白水解液质量浓度的升高，IEC-6细胞增殖率逐渐升高，且呈剂量依赖，在质量浓度为0.1 mg /mL时细胞增殖率达到最大；当质量浓度在0.1 mg /mL以上时细胞增殖率开始呈现下降趋势。综合24 h和48 h细胞增殖率数据来看，与未热处理的牛源乳铁蛋白水解液相比，除了63 ℃/30 min组，其他2 种热处理方式对乳铁蛋白的免疫活性没有明显的破坏作用，加热并没有使乳铁蛋白的免疫活性基团完全失活，4 种处理方式下的乳铁蛋白水解液最佳增殖质量浓度均为0.1 mg/mL。
巴氏杀菌后的牛源乳铁蛋白水解液对IEC-6细胞周期的影响
为探究3 种巴氏杀菌处理方式下牛源乳铁蛋白水解液对肠细胞增殖的机制，采用质量浓度为0.1 mg/mL的牛源乳铁蛋白水解物分别作用于IEC-6细胞24、48 h后，通过流式细胞术分析其对细胞周期的影响及各周期所占比例。结果显示，用63 ℃、30 min，72 ℃、15 s和85 ℃、15 s热处理条件下的乳铁蛋白水解液处理IEC-6细胞24 h后，与空白组相比，G0/G1期分布比例由85.84%分别降至61.44%、71.28%、67.80%和63.80%；处理48 h后分别从85.11%下降到61.64%、74.61%、73.58%和69.97%，且差异显着（P＜0.05）。表明牛源乳铁蛋白通过降低细胞G0/G1期比例来促进肠道细胞增殖。与未热处理的乳铁蛋白水解液相比，除85 ℃/15 s组外，其余2 种热处理方法均显着降低IEC-6细胞在G2/M＋S期的比例（P＜0.05），表明85 ℃、15 s对乳铁蛋白的免疫活性基团无明显破坏。
巴氏杀菌后的牛源乳铁蛋白水解液对IEC-6细胞凋亡的影响
结果显示所示，与空白组相比，经0.1 mg/mL牛源乳铁蛋白水解液处理24、48 h后，IEC-6细胞凋亡率尤其是晚期凋亡率明显降低。与未热处理组相比，3 种巴氏杀菌方式对乳铁蛋白活性无明显破坏作用。但随着实验时间的延长，乳铁蛋白水解液抑制细胞凋亡的作用开始减弱。
巴氏杀菌后的牛源乳铁蛋白水解液对细胞周期相关基因表达量的影响
因作用24、48 h的增殖趋势相同，本实验采用0.1 mg/mL牛源乳铁蛋白水解液刺激IEC-6细胞24 h，通过荧光定量PCR计算细胞周期相关基因表达量以阐明增殖机制。PCR结果显示，与空白组相比，除63 ℃/30 min组外，在其他3 种乳铁蛋白水解液作用下，p21表达水平显着降低（P＜0.05）。Cyclin E1可与其激酶CDK2结合，是调节细胞从G1期到S期过渡的重要基因[17]。与空白组相比，除63 ℃/30 min组外，cyclin E1基因表达量在其他3 种牛源乳铁蛋白水解液中均显着增加（P＜0.05），这表明牛源乳铁蛋白可推进细胞周期进程。
PCR结果显示，与空白组相比，cyclin B1和CDK1基因在种牛源乳铁蛋白水解液作用下表达水平均升高。结果表明，4 种乳铁蛋白水解液通过提高cyclin B1、CDK1、cyclin E1基因表达量，降低基因p21表达量，促进细胞增殖。与未热处理组相比，除85 ℃/15 s外，其余2 种热处理方式下的乳铁蛋白水解液均能显着降低cyclin B1、CDK1和cyclin E1的表达水平（P＜0.05），显着提高p21的表达水平（P＜0.05），抑制细胞周期进程，但抑制作用显着低于空白组。由此说明巴氏杀菌虽可降低乳铁蛋白的免疫活性，但并未使其完全失活。
讨 论
本研究着眼于肠道免疫，利用体外实验优化工艺参数，为新型乳制品加工提供基础研究数据。实验结果表明，与未热处理的乳铁蛋白水解液相比，3 种巴氏杀菌方式并没有使乳铁蛋白完全失活，仍可促进IEC-6细胞的增殖。通过提高cyclin B1、CDK1、cyclin E1基因表达量，降低p21基因表达量，增加细胞在G2/M和S期所占比例，推进细胞周期进程，降低细胞凋亡率。本研究结果表明，乳铁蛋白通过促进肠道细胞增殖调节肠道免疫。
结 论
巴氏杀菌后牛源乳铁蛋白均可通过增加基因cyclin B1、CDK1和cyclin E1的表达水平，降低p21的表达水平促进IEC-6细胞增殖，减缓细胞凋亡。巴氏灭菌虽可部分损伤乳铁蛋白的免疫活性基团，但不能使其完全失活。选择适宜的工艺参数如72 ℃、15 s和85 ℃、15 s可最大化地保留乳铁蛋白的免疫活性。通过体外实验得出乳铁蛋白水解液促进婴儿肠道免疫的最佳剂量为0.1 mg/mL。巴氏杀菌可以很好地保留生鲜乳中免疫蛋白的免疫活性，这为现阶段乳制品加工工艺参数设计以及营养补充剂添加量提供理论依据，为国内本土生鲜乳加工利用提供新的方向。
