大豆蛋白是一种全价蛋白，主要由β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)组成，而SPI又以蛋白质含量高达90%以上被广泛应用在食品行业中。大豆球蛋白主要通过氢键和二硫键稳定结构，具有较低的分子灵活性，并且SPI通过降低水-油界面张力促进乳液的形成，同时在水-油界面处形成膜结构，从而避免乳液聚集絮凝。作为植物次级代谢产物的多酚类物质是植物界中数量最多的物质之一，而作为单体多酚的花青素(ACN)可在食物体系中稳定其分子结构，极大的保留其功能活性。尽管以往的研究对多酚类物质与植物蛋白共价作用进行了积极探索，但共价作用的确切机制及其对Pickering乳液特性及微观结构的影响尚不清楚。
因此，东北农业大学食品学院的鞠梦楠、祝钢和隋晓楠*等人在本研究中通过ACN与SPI共价复合制备纳米颗粒，破坏SPI中的二硫键，使二者之间形成共价键，进而改善其分子间柔性较低的状态。通过流变性质，冷冻电镜与激光共聚焦显微镜分析，对比有无ACN对SPI稳定Pickering乳液的影响，这将为健康、高营养的Pickering乳液设计提供理论基础。
一、颗粒表面疏水性分析
结果显示，以ACN体积分数为横坐标作为表面疏水性的函数并用ANS-作为荧光探针。随着ACN添加量的增大，颗粒表面疏水性逐渐减小，当ACN体积分数由0%增加到0.15%时，纳米颗粒的H0由18 174降低到8 945。本研究的SPI纳米颗粒的H0明显高于其他研究，其原因可能为热处理诱导SPI去折叠，导致更多疏水性基团迁移到分子外部。此外，随着ACN含量的增加，纳米颗粒的H0逐渐降低。
二、EAI及ESI分析
结果显示，Pickering乳液的EAI与ESI随着ACN的添加逐渐增大，当ACN含量增大0.15 倍时，乳液的EAI增大了将近2 倍;乳液的ESI增大了将近1 倍。由于Pickering乳液制备过程中需要加热，由此可以推断，蛋白的二、三级结构在加热条件下发生改变，从而使油水界面处的分子重排，增加了蛋白的两亲性，进而使得乳化性能增强。
三、乳液流变分析
3.1 乳液静态流变分析
由图3A可知，所有乳液在剪切速率为0.01～100 s-1时，随着剪切速率的增大黏度逐渐下降，表现出典型非牛顿假塑性行为(剪切稀化)。Pickering乳液显着的剪切稀化行为是典型的弱缔合相互作用，疏水性植物糖原纳米颗粒稳定的乳液中形成弱的液滴网络结构。此外，在相同剪切速率下，ACN体积分数越高，Pickering乳液的黏度越大。这些结果与用SPI-ACN共价复合纳米颗粒稳定Pickering乳液的剪切应力-剪切速率一致(图3B)。SPI-ACN纳米颗粒稳定的Pickering乳液的剪切应力-剪切速率是非线性的，符合非牛顿流体的剪切稀化行为。图3B中较高的相关系数值证实了SPI-ACN Pickering乳液参数的可靠性(R2＞0.97)。此外，Pickering乳液中ACN含量的增加导致K值的增加，这与图3A中表观黏度数据相符。同时可知n值均小于1，这证实了乳液为非牛顿假塑性流体。Pickering乳液中ACN体积分数的增加导致n值的降低，因此牛顿行为的偏差增加。
3.2 乳液动态流变分析
由SPI与ACN共价复合稳定的Pickering乳液的动态流变分析结构显示，随着频率的增大，Pickering乳液的弹性模量和黏性模量逐渐增大，并且弹性模量大于黏性模量;在同一频率下，随着ACN添加量的增大，弹性模量与黏性模量逐渐增大。由此证实SPI-ACN Pickering乳液为弹性凝胶乳液，并且弹性模量的变化与频率变化无关。由结果显示，在同一剪切频率下，随着ACN添加量的增大tanδ逐渐增大并且始终小于1，这说明该Pickering乳液的弹性模量始终小于黏性模量，乳液呈现类固体特性。随着ACN体积分数的增大，tanδ值明显增大，这说明黏性模量上升幅度大于弹性模量，在此浓度范围内Pickering乳液的黏性比例逐渐增大。
四、乳液冷冻电镜分析
冷冻电镜分析有助于更清晰直观地了解乳液的微观结构。由于乳液在氮气淤浆中以相对缓慢的速率冷冻，因此当液体冻结时油结晶，暴露在冷冻乳液样品中的油滴由大晶体组成，如图5所示。随着ACN添加量的增加，蛋白颗粒大小逐渐均一密集；由蛋白颗粒自组装而成的Pickering乳液液滴逐渐减小，油滴表面附着致密的蛋白颗粒。由图5可知，随着ACN添加量的增大，乳液界面由光滑变为网络状结构，这可能是因为ACN与蛋白共价复合后促进了蛋白发生有序聚集，同时瓦解复合物中蛋白结构，使得蛋白肽链展开。
五、乳液激光共聚焦分析
使用激光共聚焦技术可以评估ACN体积分数增加对蛋白和脂滴分布的影响，如图6所示(油滴被尼罗红染为红色，蛋白被尼罗蓝染为绿色)，随着ACN添加量的增大，蛋白分布逐渐呈现网络状结构;脂滴逐渐减小，分布更加均一。该结果与上述4节冷冻电镜结果一致，这说明随着ACN的加入蛋白与脂滴在运动中受到限制，其分布形态与方式变得更加有序。这表明在高ACN体积分数下增强的液滴间相互作用很大程度上促进了网络状结构的形成。同时，由明场图片可以看出SPI-ACN纳米颗粒完全吸附稳定油滴界面，针对于出现的网络结构可能是形成了桥接乳液。由于ACN与SPI共价复合后使蛋白的肽链展开，致使乳液中两个单独的脂滴共用一层SPI-ACN颗粒层。桥接乳液的出现将显着促进网络结构的形成，同时促进聚集颗粒凝胶的形成(构建蛋白质稳定乳液的一种理想模型)。
结 论
随着ACN体积分数的增大，SPI-ACN共价复合纳米颗粒的表面疏水性逐渐下降，由其稳定的Pickering乳液的EAI、ESI逐渐增加。SPI-ACN共价复合Pickering乳液表现出典型非牛顿假塑性流体行为并且该乳液为类固体乳液。由冷冻电镜与激光共聚焦显微镜观察结果可知，随着ACN体积分数的增大，纳米颗粒表现出致密有序的排列；乳液粒度在可视范围内减小；脂滴分布更为均一；SPI-ACN共价复合Pickering乳液呈现出桥接乳液形态。
