近年，蓬勃发展的高通量测序及其数理分析研究为深入探索、解析复杂发酵体系的微生物菌群组成和结构提供了有效手段。随着浓香白酒领域的洋河、今世缘的高度机械化，清香型的劲酒机械化快速发展，在传统白酒行业掀起了新的机械化创新发展。机械化酿造不但可降低传统模式的劳动强度，还可提升酿造质量的稳定性和可控性。
为揭示机械化酿造过程中不同轮次堆积发酵微生物菌群结构的多样性、差异性，利用高通量测序及其数理分析，贵州大学酿酒与食品工程学院、贵州省发酵工程与生物制药重点实验室的王欢、黄永光*和贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司席德州等人对酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵酒醅中的微生物菌群结构及其多样性等进行系统研究，为机械化酿造酱香型白酒的发展和工艺优化提供理论指导。
1 细菌菌群结构多样性
利用Illumina MiSeq平台测序得到样品双端序列数据，再进行reads拼接以及对reads的质量和拼接效果进行质控过滤，共获得细菌的有效序列为339 310 条，通过USEARCH将标签分组成具有97%相似性的可操作分类单元（OTU），将每个OTU与数据库进行比对，选取置信度阈值，即相似度在97%以上的序列进行物种分类，得到每个OTU的分类水平，即门、纲、目、科、属分类水平。
7 个轮次中共检测出14 个门，456 个属。对所检出的菌群结构进行分析如图2所示，各个轮次机械化酿造堆积发酵酒醅中的共有优势菌门为Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes。如图2所示，随着发酵轮次的变化，主导性的菌门由Firmicutes变为Proteobacteria，这说明第1轮次堆积发酵酒醅中的细菌主要来自于添加应用的酱香大曲，且与实际生产过程中酱香型白酒酿造的下沙和造沙加曲量生产相符合。
如图3所示，在属水平上，不同轮次机械化酿造堆积发酵酒醅中的细菌菌群在数量及结构分布上多样性特征明显，但菌群的属类种别基本一致，1轮次共检测出130 个属，2轮次126 个属，3轮次129 个属，4轮次119 个属，5轮次125 个属，6轮次164 个属，7轮次136 个属。1轮次的菌属分布较均匀，相对丰度大于1%的有10 个属，包括Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Pediococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella，其中以前5 种为主（总相对丰度为84.74%）。从2轮次开始，Acinetobacter的相对丰度均大于50%，成为主导菌属。其中，2轮次的菌群多样性有所降低，共6 个属的相对丰度大于1%，包括Acinetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus和Thermoactinomyces。3、4、5轮次的产酒酒质最好，出酒率也高，被称为“大回酒”，且4、5轮次香气特征较为相似，图3 表明其菌群结构也较相似。
其中，3轮次有9 个属相对丰度大于1%，主要是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Sphingomonas和Thermoactinomyces。4轮次有9 个属相对丰度大于1%，以Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Rhodococcus、Sphingomonas和Thermoactinomyces为主。5轮次相对丰度大于1%的有8 个属，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus和Sphingomonas。6、7轮次的菌群结构也相似，6轮次有9 个属相对丰度大于1%，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Rhodococcus和Sphingomonas；7轮次共有8 个相对丰度大于1%的属，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus和Sphingomonas。机械化酿造各个轮次堆积酒醅中的共有优势菌属主要为Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia，这些菌属在部分轮次中的相对丰度都在5%以上。
上述结论表明，在酱香型白酒机械化酿造的各轮次之间参与堆积发酵并富集的微生物菌群结构多样性特征非常明显，其各轮次的菌群结构共性特征显着性大于差异性，说明各轮次酿造的酿酒微生物稳定性较好，也表征了酱香型白酒酿造过程存在固有的特征性菌群结构。
2 核心微生物菌群及其功能
本研究发现，机械化酿造不同轮次堆积发酵酒醅中的细菌平均丰度大于1%且至少出现在1 个样品以上的属有12 个，分别是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。如图4所示，该12 个菌属1～7轮次总相对丰度分别为97.98%、97.82%、97.20%、98.28%、97.52%、95.57%、95.51%，说明这12 个菌属一直稳定存在于酱香型白酒机械化酿造的堆积发酵过程，而且成为主导性菌群结构，可将其认为是机械化酿造堆积发酵过程的核心微生物结构菌群。其中，Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia在7 个轮次中的相对丰度均大于1%，且后4 种（Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia）为传统酿造酒醅中的优势菌群和功能菌群，对酒体酱香风味的形成具有重要贡献。
如图4所示，Acinetobacter在1～7轮次机械化酿造堆积发酵酒醅中均为绝对优势菌属，但1轮次中的Acinetobacter含量较其余几个轮次少，而在4、5轮次发酵酒醅中的丰度含量最高。Acinetobacter主要来源于酿酒环境的空气和生产用大曲，是一种酿造环境优势细菌。该菌属也在传统酿造堆积发酵酒醅中检出。该菌属成为机械化酿造堆积发酵中的绝对优势菌属。Bacillus在1～3轮次中丰度较高（图4），其也是大曲中的优势菌群，是酱香白酒酱香风味物质形成的主要代谢贡献菌群，能产生蛋白酶与淀粉酶等水解酶类，其水解原料形成丰富的发酵前体物质，有利于风味物质的形成。Pediococcus、Lactobacillus与Weissella属于乳酸菌菌系，乳酸菌大多是兼性厌氧或厌氧菌，在发酵过程具有重要的生物学结构调控功能。
Kroppenstedtia和Lentibacillus均被发现存在于大曲中，其在白酒生产中的具体作用尚不明确。Kroppenstedtia是1轮次中的优势菌属（图4）。Thermoactinomyces也是大曲中的优势菌属，其在1～7轮次机械化酿造堆积发酵酒醅中的丰度含量随着轮次的增加而减少（图4），在5～7轮次中丰度低于1%。图4表明，Sphingomonas在机械化酿造堆积发酵过程随发酵轮次递增，丰度呈现一致的增加趋势。同时，该菌属能够降解芳香类化合物和产生多糖类物质，还具有较强的产辅酶Q能力，该菌属也存在于传统酿造堆积发酵的部分轮次中。在机械化酿造中还检测到大量的Caulobacter，该菌属在1、2轮次中丰度含量较低，6、7轮次中含量最高，其在传统酿造堆积发酵酒醅中鲜见报道，是机械化酿造过程中的特有菌属，可能来源于机械设备和环境，在白酒发酵过程中的作用还有待进一步研究。Rhodococcus在整个群落结构中所占比例很小（图4），是一类可以从土壤等环境中分离获得的革兰氏阳性菌，属于Actinobacteria，可分泌大量的活性酶，能够充分利用有机化合物作为能源和碳源，对石油烃、有机腈和霉菌毒素等具有降解作用，且具有降解白酒酿造废水的功能。该菌属在传统酿造堆积发酵酒醅中鲜见报道，在白酒中的功能还有待进一步研究。
上述结论表明，在机械化酿造堆积发酵过程其核心菌群结构相对性稳定程度高，对堆积发酵整体菌群结构的变化调控功能明显，这也是酱香型白酒酿造过程需要堆积发酵的必要，为下一步窖池发酵的微生物多样性和稳定的菌群结构研究提供参考依据，实现高产和优质的前提条件。
3 核心微生物的相互作用
如图5A所示，12 个核心细菌属之间具有极其复杂的相互生物学作用，这些复杂的共生关系和拮抗关系形成了稳定的微生物群落结构，这也是发酵过程微生物菌群稳定性和演替的内在调控动力和机制。Bacillus、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Pediococcus和Oceanobacillus属于Firmicutes，它们之间绝大部分呈现共生关系 （图5B）。其中，Bacillus与Thermoactinomyces极显着正相关（P＜0.01）；Kroppenstedtia与Lentibacillus极显着正相关（P＜0.01）。Pediococcus与Thermoactinomyces显着正相关（P＜0.05）。Weissella与Thermoactinomyces、Lentibacillus显着正相关（P＜0.05）。Acinetobacter、Caulobacter和Sphingomonas属于Proteobacteria，Rhodococcu属于Actinobacteria，从图5C可知，该3 个菌属和其他9 个基本都呈现负相关。其中，Acinetobacter与Kroppenstedtia显着负相关（P＜0.05）；Caulobacter与Thermoactinomyces和Weissella显着负相关（P＜0.05）；Thermoactinomyces与Sphingomonas和Pediococcus极显着负相关（P＜0.01），与Bacillus显着负相关 （P＜0.05）；Rhodococcus与Weissella极显着负相关 （P＜0.01）。Caulobacter与Rhodococcus和Sphingomonas极显着正相关（P＜0.01）。从核心菌属之间的相关性结果表明，在堆积发酵的菌群多样性复杂体系中，正是因为核心菌群之间形成的共生、拮抗等生物学关系，才构成了复杂体系中的协同共生关系，维持整个发酵体系的正常、稳态发展，推进酿造进程沿袭乙醇发酵和风味富集方向发展。
4 环境因子对核心细菌菌群结构的影响
为揭示环境因子对核心细菌群落的影响，将12 个核心菌属进行环境的关联分析。如图6所示，水分、酸度、还原糖、淀粉含量对微生物群落结构有重要的影响，其中淀粉含量与其他3 个环境因子负相关（环境因子箭头间的夹角为钝角），而水分、酸度和还原糖含量正相关（环境因子箭头间的夹角为锐角），且微生物受淀粉含量、水分和酸度的影响较大。
其中，1、2轮次的微生物菌群结构受淀粉含量影响较大（淀粉分别为33.71%和31.12%），呈正相关，而 6、7轮次在淀粉含量向量的相反方向（淀粉分别为13.6%和12.21%），呈负相关。1、2轮次发酵的微生物结构与水分负相关（水分分别为43.58%和46.84%），而3～7轮次与水分正相关（由49.55%上升到55.87%）。生产实践表明， 1、2轮次发酵过程，环境温度较低，空气中的湿度已经满足微生物的生长需求，而3轮次开始，气温较高，微生物生长需要水分。1、2轮次发酵过程微生物菌群结构与酸度呈负相关（分别为0.4 mmol/10 g和1.92 mmol/10 g），而3～7轮次与酸度呈正相关（分别为2.51、3.32、4.63、3.98 mmol/10 g和3.81 mmol/10 g）；其中，5、6 轮次发酵受酸度影响较大（分别为4.6 mmol/10 g和3.98 mmol/10 g），这与生产实际也相吻合。还原糖对于微生物的结构的影响较小。
核心微生物受环境因子影响也较大，结果显示，Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus和Weissella均与淀粉含量显着正相关（R分别为0.929、1、0.786、0.786），且Bacillus与淀粉含量极显着正相关 （P＜0.01），Thermoactinomyces与淀粉含量高度显着正相关（P＜0.001）。Caulobacter与淀粉含量显着负相关（P＜0.05，R=－0.821）、Sphingomonas与淀粉含量极显着负相关（P＜0.01，R=－0.929），因为Sphingomonas降解芳香类化合物；Caulobacter可能来源于机械设备或环境。还原糖含量对核心微生物没有影响。Caulobacter和Sphingomonas与水分显着正相关（R分别为0.857、0.964），其中Sphingomonas高度正相关 （P＜0.001），而Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus与水分显着负相关（R分别为－0.857、 －0.964、－0.893），且Thermoactinomyces和Pediococcus极显着和高度负相关（P＜0.0 1，P＜0.0 0 1）。Sphingomonas与酸度显着正相关（P＜0.05，R=0.857），而Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus与酸度显着负相关（R分别为－0.857、－0.857、－0.929），且Pediococcus极显着负相关（P＜0.01），这说明酸度高、水分大会抑制大部分微生物的生长，不利于发酵的进行，因此在生产上要控制Sphingomonas的生长。
上述结果表明，在机械化酿造堆积发酵过程，环境因子水分、淀粉含量和酸度与核心细菌菌群中的菌属之间具有密切的相关性，表明堆积发酵过程水分、淀粉含量和酸度对微生物生长具有紧密的调控作用，共同形成推动发酵过程的微生物菌群结构，促进酿造发酵的正常进行。
结 论
本研究利用高通量测序及数理分析方法系统性研究酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵酒醅中的细菌菌群结构特征，7 个轮次中共检测出14 个门，456 个属，优势菌门为Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes；在属水平上，不同轮次堆积发酵酒醅中的细菌菌群在数量及结构分布上多样性特征明显，且主要核心菌群种类基本一致。根据各菌群丰度将12 种菌群定义为酱香白酒机械化酿造的核心细菌属，分别是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。
核心微生物菌群之间的物种相关性网络分析结果表明，Bacillus、Lactobacillus和Sphingomonas在酱香型白酒机械化酿造各轮次发酵过程堆积发酵核心微生物菌群中具有重要的生物学调控作用；Caulobacter与大部分核心微生物存在拮抗作用，Oceanobacillus与大部分核心菌属属于共生关系。堆积发酵过程的环境因子中，水分、酸度、淀粉含量对微生物群落结构影响较大，产生了重要的调控作用，其中Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus与淀粉含量显着正相关，与水分、酸度显着负相关；Caulobacter、Sphingomonas与淀粉含量显着负相关，与水分含量显着正相关，Sphingomonas还与酒醅酸度显着正相关。本研究为推进酱香型白酒机械化酿造发展提供了基础理论和学科依据。
