食品变质腐败泛指在微生物为主的各种因素作用下，食品降低或失去食用价值的一切变化，是一个复杂的生物化学反应过程。因此，目前尚无统一的评价标准和检验方法，主要借助微生物菌落总数、致病菌等传统的卫生指标进行检验。传统的微生物学检验方法不能满足鲜切果蔬产品便捷检测的需求，急需建立一种方便快捷的检测方法。荧光检测具有灵敏度高、选择性强等优点，目前已广泛应用于现代食品安全检测领域，但利用荧光指示菌表征果蔬产品微生物腐败的研究报道较少。
关于莲藕制品贮藏过程中的微生物污染和腐败分析，目前的研究主要集中在其优势腐败菌的分离鉴定、产品货架期预测模型等方面，而针对其腐败变质快速检测或评价方法的研究较少。在前期研究中，课题组基于聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术对鲜切莲藕冷藏过程中微生物菌相结构变化进行分析，明确了两种能自发产生荧光的特异腐败菌Pseudomonas fluorescens和P.asturiensis可作为潜在的腐败指示菌用于鲜切莲藕产品质量安全的评价和快速检测研究。长沙理工大学化学与食品工程学院、湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心的刘永乐、唐倩和俞健等人在此基础上，根据该指示菌自发荧光的特性，建立一种基于荧光显影检测鲜切莲藕产品微生物腐败的方法，并进行检测条件的优化、验证和相关性分析，以期为相关产品的质量安全评价和便捷检测新技术开发提供一定的参考依据。
1 鲜切莲藕冷藏过程中菌落总数的变化
结果显示，冷藏过程中菌落总数一直呈增长趋势，新鲜（第0天）样品为2.1×103 CFU/g，冷藏前3 d增加缓慢；此后菌落总数增长加快，第6天时达6.4×104 CFU/g。根据浙江大学食品科学与发酵工程研究所2005年起草的《蔬菜（净菜）质量安全要求》，要求其菌落总数不得超过5×104 CFU/g，因此可以认为样品在冷藏第6天时已开始腐败变质；冷藏第9天后，样品菌落总数开始急剧增加，至第12天时已达到4.3×105 CFU/g，表明已严重腐败。
2 自发荧光指示菌的确认
在前期研究中，课题组通过PCR-DGGE技术研究了冷藏期间莲藕的优势腐败菌类型和菌相结构变化，发现假单胞菌属细菌在腐败关键期开始大量增殖，逐渐成为优势腐败菌，可以作为评价鲜切莲藕产品是否腐败的重要指示菌；尤其是优势腐败菌P. asturiensis的检出时间与腐败时间一致，且可产生水溶性黄绿色荧光色素，可以通过荧光显影技术检测。
如图2所示，第0、3天样品悬液接种后没有在KB平板上长出明显菌落，可能与悬液中微生物数量较少有关；第6天后的样品才开始长出菌落，且在可见光下呈黄绿色，但对照菌液接种后一直为灰白色菌落。将平板置于紫外光下，在接种第6～12天样品处可观察到明显的荧光，对照菌则不会产生荧光，说明荧光的产生与莲藕样品的腐败菌有关。此外，样品检测出荧光的时间与DGGE图谱中P. asturiensis出现的时间一致，也与通过菌落总数指标判定莲藕样品腐败变质的时间一致。因此，理论上通过检测荧光表征样品腐败变质可行。
3 荧光强度与微生物数量的关系
如图3所示，随着莲藕冷藏时间的延长，样品悬液的荧光强度逐渐增强，尤其是第6天后荧光强度急剧上升，至第12天时达到最强（图3A），说明样品悬液中荧光指示菌产生的荧光强度与其冷藏过程中菌落总数（图1）的变化趋势基本一致。由于莲藕样品在冷藏第6天开始腐败，将冷藏6 d的莲藕样品悬液稀释后进行激光共聚焦荧光检测。样品原液的荧光强度最强，随着稀释度的增加，荧光强度逐渐减弱（图3B），说明荧光强度与指示菌数量间具有一定的正相关关系，可以根据指示菌的荧光强度表征样品的微生物污染程度，从而直观地分析其腐败情况。
4 荧光检测方法的建立
图4为不同冷藏时间的莲藕样品悬液接种KB斜面后利用凝胶成像系统照相获得的照片。各组阴性对照的斜面试管（第4支）均无荧光产生，样品试管从冷藏第6天开始检测到荧光，这一时间点与图1的结论（开始腐败的时间点为第6天）吻合。因此，可以用样品荧光指示菌的检出表征样品的微生物腐败，该方法较激光共聚焦检测更实惠，同时较传统卫生指标检测法更简单快捷。然而，可能由于划线接种量的不确定性，样品的荧光强度与其微生物菌落总数的线性对应关系还不理想，尚需对其荧光检测条件进一步优化。
5 荧光检测条件的优化
5.1 稀释度的选择
如图5所示，对照和第0天样品斜面试管均无荧光产生，而冷藏6 d以后样品的各稀释度斜面均检测到荧光，且强度基本随冷藏时间的延长逐渐增强，再次印证了利用指示菌荧光检测表征样品微生物腐败的可行性；然而，原液和稀释2.5、5 倍的第3天样品各有1 支试管检测到微弱荧光，说明不合适的样品悬液稀释度可能会影响检测结果的准确性，因此，后续选取稀释10 倍作为最佳稀释度。
5.2 接种量的确定
在不同莲藕样品均稀释度悬液均稀释10倍的基础上，进行不同接种量实验，斜面培养后的荧光检测结果如图6所示。接种量为5、10 μL的样品均第6天开始出现荧光，且随着接种量的增加，荧光强度逐渐增强；而接种量大于15 μL后，冷藏第3天样品试管也能检测到荧光，说明接种量太大造成假阳性结果。分析计算接种5 μL和10 μL实验组样品图像的IOD值，发现当接种量为5 μL时其与冷藏时间的相关性更好。因此，最终确定样品悬液稀释10 倍、接种量5 μL为荧光指示菌便捷检测方法的最优条件。
6 检测方法的验证
随机选取10 个不同冻藏时间的鲜切莲藕样本，分别以本研究的荧光检测方法和传统的微生物菌落总数分析法进行样品微生物腐败检测对比，结果显示，除冷藏第5天的样品检测到微弱荧光外，其余样品均与传统方法检测的结果一致，准确率高达90%，说明本研究建立的利用荧光指示菌检测鲜切莲藕腐败的方法可行。
结 论
本研究基于前期PCR-DGGE技术明确了鲜切莲藕冷藏过程中优势腐败菌P. asturiensis的检出时间与腐败时间点的一致性，应用其自发荧光的特点建立了一种基于荧光显影表征鲜切莲藕产品微生物腐败情况便捷检测方法。通过荧光指示菌的确认、荧光强度与微生物数量的相关性分析、荧光检测方法建立及其检测条件的优化，最终对实际样品腐败检测的验证结果与传统菌落总数检验方法基本一致。与传统微生物卫生指标检验方法相比，该荧光检测方法操作简便、结果直观，而且检出准确率高，是一种便捷可行的莲藕腐败检测方法。
