来自华南理工大学食品科学与工程学院的曹静、翁静宜和程萌等人将通过美拉德反应制备SPI-葡聚糖共价接枝物，并且根据在酸性条件下溶解度的差异将接枝物分离的产物应用于蛋白等电点附近水包油乳液及制备姜黄素纳米颗粒体系中。着重研究等电点条件下制备的美拉德反应产物与中性条件下制备的产物在水包油乳化体系中的贮藏稳定性和对疏水活性物质姜黄素的运载性能，比较两组分在不同体系中的功能性质差异，为其工业应用提供指导。探讨改变乳液pH值、添加盐离子和热处理对乳液稳定性的影响；表征纳米颗粒的荷载率、粒度、电位和微观结构，对胶体和化学稳定性进行对比，引入了一种新的包装材料。
1.SPI-葡聚糖糖基化物的形成与鉴定
SDS-PAGE分析
蛋白质染色和糖染色分离胶的顶部产生高分子质量的产物，证明大分子糖基化产物的形成。蛋白染色中，MC45组分的条带较MC65组分浅，而在糖染色中显示出相近的糖含量，说明了MC45组分接枝程度较高。蛋白质染色中，MC65组分底端中有小分子物质存在，条带较为分散。说明大分子体系条件下，蛋白发生水解生成小分子物质。糖基化物经过不同的pH值分级分离，得到的MC45组分中只存在大量高分子糖基化产物，而MC65中则存在较多小分子物质。
分子质量分析
样品在33 m in左右出现的峰形为溶剂峰。糖基化产物及其分级分离产物的出峰时间比较集中，进一步说明其分子质量的分布比较集中。与MC45相比，MC65组分出现2 个峰，在20～28 min出现的峰为糖基化产物的分子质量分布区间，紧随其后出现的小峰可能是糖基化过程中未反应及水解的蛋白组分，其平均分子质量为68913 kDa。MC45组分的平均分子质量最大，为74132 kDa，而SPI的平均分子质量为9257 kDa。结合电泳分析可知，其多糖与蛋白的糖基化程度较高，同时存在的未反应葡聚糖分子的分子质量分布与MC45组分相近，故分子质量较高且分布集中。
2.糖基化物稳定的乳液乳化性质分析
pH值对不同糖基化产物稳定的乳液性质影响
由SPI制备的乳液粒径明显受到pH值的影响，在等电点附近获得最大值（SPI制备的乳液最大粒径约为14 μm）。与中性条件下制备的乳液相比，当pH 4.5时，乳液的Zeta电位绝对值接近零，液滴间的相互排斥作用大大减弱，导致聚集作用增强。MIX制备乳液的Zeta电位与粒径变化与SPI在不同pH值条件下变化趋势几乎相近，说明未发生共价结合的葡聚糖对SPI的乳化性影响较小。由此可见，SPI-葡聚糖非共价混合物的乳化性能借助于蛋白表面静电相互排斥作用。
MC45组分制备的乳液平均粒径为10 μm左右，并且不随pH值的变化而变化。其Zeta电位值变化较小，绝对值接近零。
MC45组分在SPI等电点附近优越的乳化性质由于糖基化程度较高，为体系增加了空间位阻作用，同时展现了葡聚糖耐受pH值干扰的特性，油滴周围覆盖的糖层明显削弱了酸性环境的不利影响。与天然蛋白相比，MC65组分制备的乳液液滴表面电荷较低，与未经过分级分离的糖基化产物相近。然而，MC65制备乳液的平均粒径随pH值变化显着，在SPI等电点附近平均粒径大于30 μm。
离子浓度对不同糖基化产物稳定的乳液性质影响
随着离子浓度的增加，各组分制备的乳液液滴表面电荷显着减小。MC45组分制备的乳液Zeta电位值表明其表面电荷受到离子浓度的影响极小，其平均粒径也不受离子浓度的影响。MC65组分制备的乳液受离子浓度影响很大，一方面其糖基化程度低，多糖对蛋白的修饰作用不明显，另一方面由于组分中存在可溶解的蛋白聚集物、天然蛋白及蛋白水解物等，导致其功能特性表征较差。
热处理对不同糖基化产物稳定的乳液性质影响
在酸性条件下，天然SPI制备的乳液经过热处理后Zeta电位绝对值减小较其他组分明显，平均粒径随着温度的升高明显增加。当SPI与葡聚糖通过糖基化反应形成共价复合物后，由于葡聚糖包裹在蛋白的表面，共价复合物制备的乳液液滴表面电荷变化较小。MC45组分制备的乳液平均粒径在加热过程中变化较小，表现出较好的热稳定性。而MC65组分制备的乳液平均粒径在加热温度大于50 ℃时，粒径明显增大。
3.姜黄素纳米颗粒性能表征
荷载量分析
姜黄素水溶液浑浊，加入SPI、MIX和糖基化产物后溶液不同程度地澄清。结合姜黄素荷载量的结果，分析SPI、MIX和不同条件分级分离得到的糖基化产物对姜黄素荷载能力。中性条件下，MC45、MC65、CON 3 种复合纳米颗粒的姜黄素荷载量较高，分别为18.37、30.21 μg/mg和24.62 μg/mg。与SPI和MIX相比，糖基化产物具有良好的荷载能力。
DPPH自由基清除率分析
SPI和MIX组分在包埋姜黄素后对DPPH自由基的清除率接近，在50%～60%范围内。而CON对DPPH自由基的清除率为15%左右，其对游离基的敏感度下降，对姜黄素起到保护作用。MC45和MC65组分DPPH自由基的清除率分别为8.43%和18.33%。与MC65比较，MC45荷载量较小，但是对姜黄素活性物质的保护作用增强，原因是等电点条件下得到的MC45组分糖基化程度高。
扫描电子显微镜分析
SPI制备的姜黄素纳米颗粒呈现典型冷冻干燥样品无定型片状结构。MC45组分包埋姜黄素纳米颗粒中显示较多的圆球形结构，放大倍数后可见完整的球状结构，表明MC45通过反溶剂法包埋姜黄素主要形成了球状纳米颗粒。
结
论
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子质量测定分析显示，反应后生成大分子质量的接枝物。MC45制备的乳液在酸性环境中的粒度低于MC65，其平均粒径约为10 μm，并且受离子浓度和温度的影响较小。与天然蛋白、SPI-葡聚糖混合物及MC45相比，荷载量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率分析表明MC65组分具有更好的姜黄素运载性能，MC65组分制备的姜黄素纳米颗粒荷载量为30.21 μg/mg，DPPH自由基清除率为18.33%，其粒径最大。
