江南大学生物工程学院，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室的白 梅、刘双平、毛 健等人通过基因敲除技术敲除HO基因获得配型稳定的单倍体酵母菌株，并通过群体杂交获得二倍体HO基因缺失型酿酒酵母，并对其发酵能力进行测定。研究HO基因的缺失对黄酒酵母发酵生产能力的影响，为下一步更方便、简洁地采用基因手段研究黄酒酵母独有的代谢特性打下了基础，且诱导酵母产孢进而获得单倍体是进行酵母遗传学和育种工作极为重要的一步，它既是黄酒酵母性状遗传所必须的，又可为后续进行杂交作好亲本的准备。
1、黄酒酵母11-1单倍体的获得
G418抗性的删除
利用HO-1-FW和HO-2-RV引物对，以黄酒酵母11-1染色体作为模板进行PCR扩增，野生型菌株经扩增后得到1 953 bp大小的产物（泳道1），HO敲除盒同源整合到酵母染色体上的扩增产物大小为2 632 bp左右（泳道2），而Cre重组酶将敲除盒上的loxpG418删除后可以扩增到1 028 bp左右的条带（泳道3），证明抗性标记基因G418已被成功删除。
黄酒酵母单倍体的分离及接合型鉴定
以酵母染色体基因组为模板，利用F-FW和A-RV、F-FW和α-RV两对引物对同时进行PCR扩增。若所扩增酵母为a型单倍体则仅可得到F-FW和A-RV扩增出的544 bp片段，无法得到F-FW和α-RV扩增片段；若所扩增酵母为α型单倍体，则仅可得到F-FW和α-RV扩增出的404 bp片段，无法得到F-FW和A-RV扩增片段；若所扩增酵母为二倍体，则两对引物对的扩增片段均可获得。
2、二倍体黄酒酵母11-1-HOΔ工程菌的获得
二倍体黄酒酵母11-1-HOΔ工程菌的验证
将两种接合型（a型和α型）的单倍体菌株进行群体杂交获得二倍体黄酒酵母11-1-HOΔ工程菌，长出菌落使用引物MAT/MAT-a/MAT-α进行PCR鉴定。
二倍体黄酒酵母11-1-HOΔ工程菌的产孢镜检结果
将黄酒酵母11-1-HOΔ在Mcclary培养基上进行培养，显微镜观察子囊孢子野生型与黄酒酵母11-1-HOΔ并无异常，说明HO基因的缺失对酿酒酵母的生孢能力是没有影响的。
3、黄酒发酵液特性分析
因为黄酒为好氧发酵，在发酵前期的时候由于发酵体系不稳定，数值稍有波动，但到前酵结束黄酒发酵后期，发现野生型黄酒酵母11-1和黄酒酵母11-1-HOΔ之间黄酒发酵液常规理化指标差异并不大。
结 论
本实验通过用醋酸锂转化法敲除黄酒酵母11-1的HO基因，利用Cre/loxp系统除去引进HO敲除基因框所带进的抗性基因KanMX，获得不含外源抗性基因且不能发生接合型转变的黄酒酵母11-1单倍体菌株（a型和α型），然后通过群体杂交最终得到了二倍体黄酒酵母11-1-HOΔ，根据实验结果可知，黄酒酵母11-1野生型酵母菌和黄酒酵母11-1-HOΔ两者之间的发酵能力并无差异，HO基因的缺失不会对黄酒发酵生产过程产生影响。获得的配型稳定的黄酒酵母单倍体菌株可用于后续的基因改造，研究黄酒酵母的遗传和代谢特性；同时单倍体菌株具有接合能力，也可进一步杂交育种，获得性能优良的酿酒酵母用于工业生产中，对维护和提升生产企业的经济效益具有十分重要的意义。
