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各国药典对HPLC方法的规定,速来围观!

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-12-04
核心提示:  所谓药典方法,顾名思义,药典专论所收载的方法,但是否每个人都知道,药典方法考虑到各个实验室的差异,有一定的可调范围。
   所谓药典方法,顾名思义,药典专论所收载的方法,但是否每个人都知道,药典方法考虑到各个实验室的差异,有一定的可调范围。下面我们具体的来探讨一下这个问题吧!
 
  一、中国药典2015规定
 
  0512高效液相色谱法规定如下:品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外,其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等,均可适当改变,以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时,当小比例组分的百分比例 X 小于33%时,允许改变范围为0.7X ?1.3X ; 当X大于33%时,允许改变范围为X —10%?X+ 10%。
 
  由上文可知,中国药典专论方法除填充剂种类、流动相组分(比例调整在规定范围内)、检测器类型不得改变外,其他条件改变了,还是认为是药典方法。但中国药典没有规定方法确认之说,所以,即使是中国药典方法,也是应该按分析方法验证的相关规定进行全套的方法验证。
 
  二、美国药典41规定
 
  USP41 <621> CHROMATOGRAPHY 规定如下:
 
  为符合系统适用性的要求而调整的操作条件是允许的,除非专论项下另有规定,下面为所列的最大的可调范围,这些调整需要额外的确认数据。为确认新条件对方法的适用性,评估调整对相关分析性能特征存在的潜在影响。多条件的调整,将对系统性能产生累积影响,实施前需仔细考虑。
 
  1、pH of mobile phase(HPLC): 流动性缓冲液的pH:±0.2 units,适用梯度及等度。
 
  2、Concentration of salts in buffer (HPLC):  ±10%(pH允许情况下),适用梯度及等度。
 
  3、Ratio of componentsin mobile phase (HPLC):
 
  流动相中组分(≤50%)可以在此比例上再调节±30%,且任一组分比例的调节不应超过±10%(相对于总的流动相),含三组分的流动相的调节可以分组分进行,含双组分的流动相的调节可在最小的组分进行,双组份和三组分的调节实例如下:
 
  双组分:例如流动相50:50,其中一组分50%的30%是15%,但是它超过了占总体比例±10%的规定,所以这个流动相比例的调节范围应以±10%为限,可以在不超过40:60~60:40的范围之间调节。再例如流动相比例为2:98,其中小组分2%的30%是0.6%,这个值不超过占总体比例±10%的规定,此流动相的比例可以在不超过1.4:98.6~2.6:97.4的范围之间调节。
 
  三组分:例如流动相60:35:5,它的次组分35%的30%是10.5%,但是它超过了占总体比例±10%的规定,所以这个流动相比例中的次组分的调节范围应以±10%为限。对于最小组分5%的30%是1.5%。可以在不超过50:45:5~70:25:5或58.5:35:6.5~61.5:35:3.5的范围之间调节。
 
  4、Wavelength ofUV-visible detector (HPLC): 专论中规定的检测波长不允许改变,检测器供应商的程序或另一个验证程序来说明,波长检测误差,最多不得超过±3nm。
 
  5、Stationary phase
 
  Column length (GC): 可以在±70%范围内调节。
 
  Column length (HPLC): 见粒径项下。
 
  Column inner diameter (HPLC): 如果线速度保持恒定,可以调整。见HPLC流速。
 
  Column inner diameter (GC): 最大可调整至±50%。
 
  Film thickness (capillaryGC): 最大可在?50% to100%调整。
 
  6、Particle size(HPLC): 等度洗脱:粒度和柱长均可以修改,但柱长与粒度的比值(L/dp)恒定或在规定柱长与粒度的比值的-25%~+50%范围内。或者(当粒度通过表面多孔颗粒调整时),其它柱长(L)和粒度(dp)的柱子可以使用,但理论塔板数N应在规定柱的-25%~+50%范围内。如果调节导致更高的理论塔板数时应注意,这样将产生更小的峰容量,应通过缩小额外柱外峰拓宽的因素调整,例如仪器的管路、检测器的体积、采样速率和进样体积。当专论中未规定粒度时,该比值应采用规定柱的最大粒度计算。
 
  7、Particle size (GC): 如果色谱图的符合系统适用性要求以及粒径范围比相同,粒度大小可以从大变小或从小变大,粒径范围比的定义是最大粒度直径除以最小粒度直径。
 
  8、Flow rate (GC): 流速可以最大在±50%调整。(备注:如果专论中规定了线性速度参数,如果载气系统可以按设置的控制,线性速度可以在 +50%~ ?25%范围内调整)
 
  9、Flow rate (HPLC):当粒度改变时,流速也许需要调整,因为为达到相同的性能,小粒度的柱子需要更高的线速度(测量通过较少塔板高度),流速、柱内径、粒度通过下面公式换算。
 
  F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]
 
  其中:
 
  F1
 
  = 专论中规定的流速;
 
  F2
 
  = 调整后的流速;
 
  dc1
 
  =专论中规定的柱内径;
 
  dc2
 
  =使用的柱子的柱内径;
 
  dp1
 
  =专论中规定的柱子粒度;
 
  dp2
 
  =使用的柱子粒度。
 
  对于等度洗脱,如果粒度从≥3μm变化到<3μm时,将增加线速度(通过调整流速),如果柱效不下跌20%以上,相同地,如果粒度从<3μm变化到≥3μm时,应减少线速度(流速)来避免柱效降低20%以上。梯度洗脱:流速、柱内径、粒度将不允许调整。另外,流速可以在±50%调整。(只适用于等度洗脱)
 
  三、欧洲药典9 规定
 
  EP 2.2.46 ChromatographicSeparation Techniques 规定如下:
 
  1、液相色谱-等度洗脱
 
  (1)Composition of themobile phase:小组分的数量可以在相对±30%或绝对±2%范围内调节,两者取其大。(例如:流动相中次组分占10%,按相对±30%它的可调范围在7%~13%,按绝对±2%它的可调范围在8%~12%,取较大者7%~13%;再例如:次组分为5%时,按相对±30%它的可调范围在3.5%~6.5%,按绝对±2%它的可调范围在3%~7%,取较大者3%~7%),但须确保组分的绝对调节量不得超过10%。
 
  (2)pH of the aqueouscomponent of the mobile phase:除非专论中另有规定,用于配制流动相的pH可以在规定的值或范围的±0.2以内调节。如果待测品为非电离物质(中性物质),pH可在±1.0范围内调节。
 
  (3)Concentration ofsalts in the buffer component of a mobile phase:用于配制流动相的含水缓冲液的盐的浓度可在±10%范围内调节。
 
  (4)Flow rate:一般调节范围为±50%,若柱尺寸改变了,流速可以更大范围内调节,具体可按下述公式来计算。
 
  (5)Column parameters:
 
  Stationary phase:固定相的属性不能改变(例如:不能用C8来代替C18);
 
  particle size:最多可减小50%,不允许增加。
 
  Column dimensions:长度可以±70%范围内调节,内径可在±25%范围内调节。当柱的尺寸改变时,流速通过下面公式进行调节。
 
  F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]
 
  其中:
 
  F1
 
  = 专论中规定的流速,ml/min;
 
  F2
 
  = 调整后的流速,ml/min;
 
  l1
 
  =专论中规定的柱长,mm;
 
  l2
 
  =使用的柱子的柱长,mm;
 
  d1
 
  =专论中规定的柱内径,mm;
 
  d2
 
  =使用的柱子的内径,mm。
 
  (6)Temperature:当专论中规定了柱温时,可以±10℃范围内调节,除非另有规定。
 
  (7)Detector wavelength:不允许改变。
 
  (8)Injection volume:若待检峰的灵敏度和重复性好的话可以减小,不允许提高。
 
  2、液相色谱-梯度洗脱
 
  梯度洗脱的液相条件调节需比等度洗脱的更加慎重。流动相的组成/梯度洗脱可以在符合下述条件的前提下进行小范围的调节:
 
  满足系统适应性的条件;
 
  主峰的出峰时间在原定保留时间的±15%以内;
 
  流动相中最终组分的洗脱能力的强度不得弱于原规定组分;
 
  如果系统适应性的条件达不到,则通常首选考虑滞留体积或更换柱子。
 
  (1)Dwell volume滞留体积(死体积):仪器的结构将会大大的改变分离度、保留时间、相对保留时间,如果这些发生,是由于滞留体积过多。专论中通常在梯度洗脱时先进行等度洗脱。考虑到方法开发系统和实际系统的滞留体积的不同,所以梯度洗脱的时间应该足够。所以使用者在进行方法确认时应确认等度洗脱的时间。如果洗脱时的滞留体积在专论中有规定,则开始洗脱的时间点(t min)应该被调节时间点(tc min)替代。用下面公式计算
 
  式中:
 
  D:滞留体积,ml;
 
  D0:方法开发时的滞留体积,ml;
 
  F:流速 ml/min。
 
  如果方法的验证没有包括该步骤,用于上述目的的等度的描述可以被省略。
 
  (2)pH of the aqueouscomponent of the mobile phase含水相的流动相pH:不允许调节。
 
  (3)Concentration of salts in the buffer component of a mobile phase流动相中缓冲液盐的浓度:不允许调节。
 
  (4)Flow rate流速:当柱子的内径改变时,调节是可以接受的,具体见流速公式。
 
  (5)Column parameters柱参数
 
  Stationary phase固定相:固定相的属性不能改变(例如:不能用C8来代替C18);
 
  particle size粒径,不允许调节。
 
  Column dimensions柱尺寸:长度可以±70%范围内调节,内径可在±25%范围内调节。当柱的尺寸改变时,流速按照下面的公式进行计算并调节。
 
  (6)Temperature柱温:当专论中的检测方法规定了具体的柱温时,温度可在±5℃范围内调节,除非另有规定。
 
  (7)Detector wavelength检测波长:不允许改变。
 
  (8)Injection volume进样体积:若待检峰的灵敏度和重复性可满足的话可以减小,不允许提高。
 
  3、Gas chromatography气相色谱
 
  (1)Column parameters柱参数
 
  Stationary phase固定相:粒径最多可减少50%,不允许增加(填充柱)。膜厚可以在-50%~+100%范围内调节(毛细管柱)。
 
  Column dimensions柱尺寸:色谱柱长度可以±70%范围内调节,色谱柱内径可以在±50%范围内调节。
 
  (2)Flow rate流速(GC):可以在±50%范围内调节。
 
  (3)Temperature柱温(GC):可以在±10%范围内调节。
 
  (4)Injection volumeand split volume进样体积和分流比:若待检峰的灵敏度和重复性可以满足的话,可以调节。
 
  USP与EP规定的可调范围基本一致,相较于梯度洗脱,EP药典更加谨慎,基本上不允许进行过多的调整。此外药典方法,EP与USP均要求进行方法确认,并且明确指出,药典方法可以不进行全套的验证。
 
 
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