来自河南科技大学食品与生物工程学院的罗磊、董金龙和朱文学等人用三相分离法分离纯化金银花中的POD，一方面有助于纯化参与酶促褐变的相关酶，为进一步深入研究金银花中酶促褐变途径提供依据；另一方面对扩展三相分离体系在植物组织中酶的纯化方面的应用具有积极意义。
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单因素试验结果
1.1
pH值对金银花POD回收率和纯化倍数的影响
回收率和纯化倍数都呈现先上升再下降的趋势，在pH 3～4和6～7之间变化程度较大，在pH值为6时达到最佳的提取纯化效果。
1.2
硫酸铵对金银花POD回收率和纯化倍数的影响
在硫酸铵质量浓度为40 g/100 mL时，回收率和纯化倍数达到最大值，分别达到75.4%和5.36。当硫酸铵质量浓度大于40 g/100 mL时，纯化倍数下降较快，回收率缓慢下降。
1.3
提取液与叔丁醇体积比对金银花POD回收率和纯化倍数的影响
提取液与叔丁醇体积比从1∶0.5改变到1∶1时，回收率和纯化倍数上升较快，提取液与叔丁醇体积比为1∶1.5时，回收率和纯化倍数达到最大值，分别为77.4%和5.67。
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金银花POD提取纯化的响应面结果
2.1 模型建立与显着性检验结果
对回归模型进行方差分析，纯化倍数二次回归模型的F值为381.432，P值小于0.000 1，表明模型达到了极显着水平；失拟项检验F值为2.873，P值大于0.05，说明失拟项差异不显着，拟合不足是不显着的；试验模型的决定系数R2值为0.997，说明试验结果与模型预测结果有着良好的一致性。
2.2 模型双因素交互作用效应分析
pH值（X1）和提取液与叔丁醇体积比（X3）之间的交互作用对回收率和纯化倍数的影响达到极显着水平。最优组合为pH 5.60、硫酸铵质量浓度39.49 g/100 mL、提取液与叔丁醇体积比1∶1.38。在该条件下纯化倍数为5.849，回收率为87.64%。新鲜金银花中POD比活力为2 086.5 U/g，经三相法分离纯化，POD比活力为1 021.6 U/mg。
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金银花POD的非变性凝胶电泳结果
经过三相分离法的初步纯化，部分杂蛋白被去除。由于POD可将愈创木酚氧化为红褐色物质，从活性染色结果可以看到2 条较明显红褐色条带，说明该品种金银花具有2 种POD同工酶。
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脱色效果测定结果
在380、400、420、440、460 nm波长范围内对色素浓度与吸光度进行线性拟合，R2分别为0.974 2、0.976 0、0.988 2、0.971 2、0.961 6，在420 nm波长处色素浓度与吸光度的线性关系最优，因此选择420 nm作为色素浓度测定波长。在回归方程优化得出因素水平的最优组合条件下色素清除率可达92%。
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金银花POD最适温度及热稳定性分析
金银花POD相对酶活力在10～70 ℃范围内呈现先上升再下降的趋势，相对酶活力在30 ℃时达到最大值，在温度超过50 ℃后相对酶活力下降迅速，70 ℃时相对酶活力只有33%。从金银花POD热稳定性曲线可以看出在10～40 ℃范围内相对酶活力较为稳定，40 ℃时相对酶活力为77.1%，同时温度大于40 ℃后，酶稳定性迅速下降，70 ℃保温1 h，相对酶活力为7.7%。
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金银花POD最适pH值及pH值稳定性分析
金银花POD在pH 4～7范围内有较高活性，该酶的最适pH值为5，在pH值为4时相对酶活力为87%，pH值为6时相对酶活力为84%；从pH值稳定性曲线中可以看出在pH值在2～5范围内酶稳定性变化明显，相对酶活力从20%上升到100%，pH值在5～9范围内酶稳定性变化较缓慢，相对酶活力从100%变化到71%。可能是pH值小于4的酸性环境对金银花POD分子结构稳定性影响较大，在pH 4～7的碱性环境中酶的分子构象较稳定。
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底物浓度对金银花POD反应速率的影响
当H2O2溶液浓度一定时，POD对愈创木酚的Km值为8.12 mmol/L，vmax值为1.71 mmol/（min·L）。当愈创木酚溶液浓度一定时，H2O2的Km值为0.822 mmol/L，vmax值为1.38 mmol/（min·L）。
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金银花POD的底物专一性
金银花POD与底物的亲和力由强到弱依次为邻苯三酚、邻苯二酚、联甲氧基苯胺、愈创木酚。
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抑制剂和金属离子对金银花POD活力的影响
Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋对金银花POD有一定激活作用，其中Ca2＋在较低浓度条件下可以起到激活作用，Zn2＋在较高浓度条件下可以起到激活作用，Cu2＋的激活作用随浓度增大逐渐增强。Mg2＋、Mn2＋对金银花POD有抑制作用，其中Mn2＋抑制作用较强。Na＋对酶的作用不明显。抑制剂柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠对金银花POD均有一定抑制作用，抑制作用随浓度增大逐渐增强，在10 mmol/L浓度下，抗坏血酸和L-半胱氨酸可以完全抑制酶活性。表面活性剂十二烷基磺酸钠对金银花POD有一定抑制作用，且在高浓度条件下抑制作用较强。
结 论
最优纯化条件为pH 5.60、硫酸铵质量浓度39.49 g/100 mL、提取液与叔丁醇体积比1：1.38，在该条件下纯化倍数为5.849，回收率为87.64%。金银花过氧化物酶比活力为1 021.6 U/mg，色素清除率为92%；酶学性质研究表明：金银花过氧化物酶最适温度为30 ℃，热稳定范围为10～40 ℃；最适pH值为5，pH值稳定范围为4～7。在金银花过氧化物酶催化的双底物酶促反应中，当H2O2浓度一定时，酶对愈创木酚的Km值为8.12 mmol/L，vmax值为1.71 mmol/（min·L）。当愈创木酚浓度一定时，H2O2的Km值为0.822 mmol/L，vmax值为1.38 mmol/（min·L）。金银花过氧化物酶与底物的亲和力由强到弱依次是邻苯三酚、邻苯二酚、联甲氧基苯胺、愈创木酚。Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋对金银花过氧化物酶有激活作用，Mg2＋、Mn2＋、柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、十二烷基磺酸钠对金银花过氧化物酶有不同程度的抑制作用。
