猪肉在我国肉制品中占据主要地位，我国是世界上最大的猪肉生产国和消费国。近年来猪肉价格持续走低，使得猪肉掺假的成本越来越低，不法商贩往往将廉价的猪肉掺入到牛肉、羊肉、驴肉等价格较高的肉类中，以次充好。河南科技大学食品与生物工程学院的朱 凯、康怀彬和许昌学院食品与生物工程学院的王德国以间苯二酚钠盐为指示剂，目的是建立更简单、更实用的可视化LAMP猪肉检测方法。
1、不同线粒体DNA提取方法对比
不同提取方法提取DNA的LAMP实验结果均为明黄色，简化后的猪线粒体DNA提取方法实际LAMP效果与试剂盒法相似，提取时间仅为原来的一半，且试剂更为安全，此后实验均用简化后的DNA提取法。
2、预实验结果
反应60 min后空白对照未变色呈橘红色，阳性对照完全变色，呈明黄色。
3、LAMP温度优化实验结果
在56 ℃时，作为空白对照的1变为明黄色，出现假阳性，不是最适温度。57 、58 ℃在60 min均为空白对照全不变色、阳性对照全部变色，结果均符合实验要求，因此选择反应时间较短的57 ℃为最适反应温度。
4、LAMP体系优化实验结果
Mg2＋是较为重要的试剂之一，反应过程中起到降低反应所需要的活化能的作用，较高时容易出现假阳性，较少时混合溶液颜色偏淡难以区分，Mg2＋浓度4 mmol/L变色时间较3.5 mmol/L组少10 min且颜色对比更明显。因此选择Mg2＋较少、对比明显、反应时间较短， 即Mg2＋浓度4 mmol/L为最适Mg2＋浓度。
5、LAMP特异性实验结果
LAMP反应60 min后，只有加入猪DNA的1和2变色，而空白对照15、16以及阴性对照3～14均不变色，且荧光定量LAMP实验表明，仅加入猪DNA的1有明显的扩增曲线，其他组均未出现。
6、LAMP灵敏度实验结果
57 ℃水浴加热60 min后，2、3、4均变色且变色明显，1、6、7、8完全不变，5微变，说明该方法可以有效检测DNA质量浓度10 pg/μL以上掺假样品，检测1 pg/μL则不稳定，难以检测DNA质量浓度在1 pg/μL以下的样品。因此，此方法能检测猪肉含量1%及其以上的样品，灵敏度为10 pg/μL。
7、LAMP稳定性、适应性实验结果
在60 min的实验时间内，该体系能且只能对猪线粒体DNA进行扩增，对其他常见各种肉类均无扩增，且实验过程中未出现假阳性，表明该LAMP法稳定性良好。
8、其他方法比较验证
当实验进行到45 个循环（即22.5 min）时，阳性组开始扩增，到75 个循环（即37.5 min）达到扩增峰值，随后进入平台期，阴性实验组在120 个循环内均未出现明显的扩增，反应曲线平缓，未出现峰值。
9、实时荧光定量PCR分析
阳性实验组在40 个循环内完成扩增，熔解曲线Tm为79.25 ℃，与阴性实验组对比明显，阴性实验组未扩增，且无Tm值，进一步证明了引物特异性良好。
结 论
本实验建立了检测常见肉制品中猪肉成分的可视化LAMP检测方法，并针对该方法进行了模板基因提取方法的简化，极大地简化了实验过程，降低了实验时间和条件，灵敏度为10 pg/μL，避免了常规LAMP法易出现假阳性的问题。进一步降低了成本，缩短了实验时间，简化实验条件。猪肉成分掺假检测中，从提取DNA到观测结果时间最短为2 h，并且重复性和稳定性效果良好，相较于其他猪肉检测方法具有成本更低、操作更简单、特异性强、灵敏度高等优点，相较于其他LAMP检测法具有可视化、不易污染、基因提取方便的特点，适用于多种常见肉制品猪肉掺假快速检测。
