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有关沙门氏菌检测的相关知识汇总

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-04-12
核心提示:通过人或动物的消化道传播,在各类食物中毒案例中排前两位,主要并发症为肠胃炎、败血症。
   一、沙门氏菌简介:
 
  通过人或动物的消化道传播,在各类食物中毒案例中排前两位,主要并发症为肠胃炎、败血症。
 
  常见的被污染食品为:
 
  肉制品:美国约20%,日本约10.3%,英国约9.9%;
 
  蛋制品:3.9%~43.7%,取决于蛋壳污染程度;
 
  蔬菜:欧美生食较多。
 
  污染的原因:
 
  生前带菌交叉污染;
 
  带菌者污染;
 
  患病者污染;
 
  水源污染。
 
  二、沙门氏菌生物学特性:
 
  肠杆菌科,沙门氏菌属,6个亚属I~VI,亚属III称为亚利桑那菌。
 
  沙门氏菌为革兰氏阴性菌,短杆菌,无芽孢,无荚膜,周生鞭毛,有动力(也有无动力的变种),需氧兼性厌氧,35℃~37℃为最适生长温度,pH6.8~7.8为最适,能在营养琼脂上生长,菌落直径2~3mm,圆形或卵形,无色半透明,液体培养基中混合均匀生长。
 
  不发酵乳糖、蔗糖,不液化明胶,不能分解蛋白质,也不产生靛基质,不分解尿素,有规律的发酵葡萄糖并产生气体。
 
  与埃希氏菌属的主要区别在硫化氢反应和乳糖反应。
 
  对热及外界环境抵抗力中等,60℃ 20~30min即被杀死,普通水中不易繁殖但可存活2~3周,自然环境粪便中生存1~2月,干燥垫草中生存8~20周,冰箱中生存3~4月,-5℃存活10月;
 
  对化学药品抵抗力较弱,对氯霉素敏感,5%苯酚5min即可杀死,胆盐、煌绿及孔雀绿抑制作用大但对肠杆菌抑制作用弱,可用以制备选择性培养基。
 
  三、沙门氏菌抗原构造和分类:
 
  菌体抗原,记为O抗原,多糖-类脂-蛋白质复合物,加热至100℃2.5h不能被破坏,也不能被乙醇和0.1%石碳酸破坏,多糖决定O抗原特异性,用于分群。
 
  鞭毛抗原,记为H抗原,蛋白质,不耐热,60℃15min或乙醇处理后被破坏,沙门H抗原有两种,第一相特异相,第二相非特异相,用于分型。
 
  表面抗原,要求掌握Vi抗原,糖脂,60℃30min或100℃5min即可破坏,可阻止O抗原与O抗体的特异性凝集反应,但Vi抗原被破坏后O抗体仍可和相应的O抗原凝集。
 
  四、变异性
 
  4.1 S-R初次分离菌株一般是光滑型,经长期人工传代培养,菌体特意多糖抗原丧失,在盐水中自凝。
 
  4.2 H-O有鞭毛的细菌失去鞭毛的变异。
 
  4.3 位相变异 双相H抗原的沙门氏菌变成只有其中某一相H抗原的单相菌。
 
  沙门氏菌血清学分型时,如遇到单相菌,特别是只有第二相时,需反复分离和诱导出第一相方可鉴定。
 
  4.4 V-W 失去Vi抗原
 
  五、检验原理
 
  食品中沙门氏菌含量较少,且常由于食品加工过程使其受到损伤而处于濒死状态,所以对某些加工食品(一般生鲜蛋或肉类)必须经过前增菌处理,即无选择性的培养基使其恢复活力,再进行选择性增菌,使沙门增殖,其他大多数细菌收到抑制。
 
  利用沙门的生化特征,借助于三糖铁、靛基质、尿素、KCN、赖氨酸等试验可与肠道其他菌属相鉴别。
 
  通过菌种特殊的抗原结构(O抗原为主),可以把他们分辨出来。
 
  复活(前增菌)→培养(选择性增菌)→分离(平板划线分离培养)→鉴定(生化鉴定/血清鉴定)
 
  六、操作步骤
 
  6.1 前增菌
 
  25g(ml)检样放入225ml缓冲蛋白胨水BPW(Buffered Peptone Water)均质(建议拍打式均质器),36℃±1℃培养8~18h。
 
  酸性或碱性样品需用1mol/ml无菌氢氧化钠或盐酸调节pH至6.8±0.2,用试纸测量。
 
  6.2 增菌
 
  摇动增菌培养物,移1ml转种于10ml四硫磺酸钠煌绿TTB增菌液中,42℃±1℃培养18~24h。适合除伤寒副伤寒沙门氏菌培养。浅黄色。
 
  同时,移1ml转种于10ml亚硒酸盐胱氨酸SC增菌液中,36℃±1℃培养18~24h。适合伤寒副伤寒沙门氏菌培养。
 
  亚硒酸氢钠对革兰氏阴性菌G-有毒,磷酸盐中和毒性,促沙抑大,亚硒酸盐还原时,pH上升,乳糖分解产酸,磷酸盐缓冲,维持培养基中性。煮沸,流动蒸汽灭菌,不能高压灭菌。
 
  6.3 分离
 
  6.3.1 亚硫酸铋(BS)琼脂平板:强选择性,强烈抑制大肠类,略抑制沙门,需延长培养时间,无乳糖指示系统,有硫化氢指示系统。还原亚硫酸铋为硫化铋,产物为黑色或褐色,亚属III有金属光泽。灭菌方式为煮沸3次。本身为绿色。
 
  用接种环取增菌液1环,划线接种,36℃±1℃培养40~48h。
 
  典型菌落为黑色或褐色,亚利桑那菌为黑色有金属光泽。
 
  6.3.2 三种平板任选其一,用接种环取增菌液1环,划线接种,36℃±1℃培养18~24h。
 
  木糖赖氨酸脱氧胆盐XLD:产生硫化氢,黑色中心周边无色。
 
  HE琼脂:分解乳糖为黄色,不分解乳糖为蓝绿色或蓝色。
 
  科玛嘉沙门氏菌显色平板:沙门氏为紫红色,埃希氏菌为蓝色。
 
  6.4 生化试验及初步血清学鉴定
 
  6.4.1 初步鉴定
 
  平板上挑取2~5个典型或可疑菌落,分别接种三糖铁TSI(表面划s,内部穿刺)和赖氨酸脱羧酶,36℃±1℃培养18~24h,必要时延长到48小时。
 
  三糖铁阴性为绛红色,阳性为黄色。
 
  大肠发酵乳糖,令三糖铁斜面和底层变为黄色。
 
  大肠具有某种氨基酸的脱羧酶,可使氨基酸脱去羧基产生氨和二氧化碳,氨使pH>7,此时指示剂溴麝香草酚蓝显蓝色(偏紫色),酸性为黄色。
 
  因此可排除三糖铁琼脂内斜面产酸(阳性)、底层产酸(阳性)、赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株。
 
  其他反应结果均有沙门氏菌属的可能,也均有不是的可能。
 
  6.4.2生化试验
 
  初步鉴定的同一批菌落,接种尿素琼脂pH7.2和胰蛋白胨水(靛基质)、氰化钾培养基,36℃±1℃培养18~24h,必要时延长到48小时。
 
  靛基质试验(吲哚):
 
  埃希氏菌能分解蛋白胨中的色氨酸,产生的靛基质与对二甲氨基苯甲醛结合,形成红色化合物。
 
  将被检细菌接种到胰蛋白胨水培养基中,培养后滴加数滴试剂于培养基液面,轻轻摇动,观察结果。
 
  出现红色为阳性,出现黄色为阴性。阳性对照是埃希氏菌,阴性对照是产气肠杆菌。
 
  尿素酶试验:
 
  某些细菌具有尿素酶,如变形杆菌,在含有尿素的培养基中,能分解尿素,产生氨,使培养基呈碱性,此时培养基中酚红指示剂显红色。
 
  把被检细菌接种到尿素固体斜面培养基上,培养4h检查一次,再每天检查一次,培养5天,观察结果。
 
  出现红色为阳性,阳性对照菌是变形杆菌,阴性对照菌是大肠埃希氏菌。
 
  反应序号A1:硫化氢阳性,靛基质阴性,尿素琼脂阴性,氰化钾阴性,赖氨酸脱羧酶阳性为典型反应,判定为沙门氏菌属。尿素、氰化钾、赖氨酸脱羧基三项中有两项异常,为非沙门氏菌。
 
  反应序号A2:硫化氢阳性,靛基质阳性,尿素琼脂阴性,氰化钾阴性,赖氨酸脱羧酶阳性,需补做甘露醇和山梨醇试验。沙门氏菌靛基质阳性变体两项都是阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
 
  反应序号A3:硫化氢阴性,靛基质阴性,尿素琼脂阴性,氰化钾阴性,赖氨酸脱羧酶多数阳性,少数阴性,补做ONPG,阴性为沙门氏菌,赖氨酸脱羧酶基本阳性,只有甲型副伤寒沙门阴性。
 
  ONPG即O-nitrophenyl-β-D-galactopyranside邻硝基酚-β-D-半乳糖苷。发酵乳糖的细菌有两类酶,渗透酶和β-半乳糖苷酶,渗透酶将乳糖分子带入菌细胞内,β-半乳糖苷酶可将乳糖的β-半乳糖苷链切断,产生葡萄糖和半乳糖。迟缓发酵乳糖的细菌缺乏渗透酶,ONPG渗入细胞内,被β-半乳糖苷酶分解产生邻位硝基苯酚,显黄色。将被检细菌接种到1%的乳糖肉汤琼脂培养基上,37℃培养过夜,取菌苔接种于0.25ml生理盐水中做成悬液,加入1滴甲苯,并充分震摇,使酶释放。在悬液中再加入ONPG液0.25ml,混匀,置于37℃培养箱或水浴箱中,分别在20min和3h后观察培养液反映结果。呈黄色为阳性,一般在20~30min即显黄色,不出现黄色为阴性。阳性对照菌为枸缘酸盐杆菌、亚利桑那菌,阴性对照菌是沙门氏菌。
 
  6.4.3 自动鉴定方法
 
  根据初步鉴定结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浓度适当的菌悬液,使用API20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统进行鉴定。
 
  6.5 A-F多价诊断血清凝集试验
 
  当图片染色和生化反应都疑为沙门氏时,应用沙门氏属A-F群多价O诊断血清进行凝集试验,同时用生理盐水作对照。
 
  6.5.1 抗原准备
 
  1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验的抗原。
 
  O血清不凝集时,将菌株接种在2%~3%琼脂培养基上再检查,挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液,酒精灯火焰上煮沸后在检查。检查是否Vi抗原作用。
 
  H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板中央,菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查,或将菌株通过装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1~2次,自远端取菌培养后在检查。
 
  6.5.2 多价菌体抗原O鉴定
 
  在玻片上划出两个约1cm×2cm区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一个区域上部,在其中一个区域下部加入一滴生理盐水,作为对照。再用无菌接种环或针分别将两个区域菌落研成乳状液。将玻片倾斜,摇动混合1分钟,并对着黑暗背景观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
 
  6.5.3 多价鞭毛抗原H鉴定
 
  与菌体抗原类同。
 
  七、检查结果
 
  综合生化试验和A-F多价诊断血清凝集结果,报告:25g(ml)样品检出或未检出沙门氏菌,必要时将菌株送至专业检验检疫部门进一步血清学鉴定。
 
 
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