鉴于前人对益生元、益生菌及合生元等益生特性的研究，来自天津商业大学生物技术与食品科学学院的臧凯丽、江 岩、陈庆森等人采用对便秘、腹泻等肠道疾病有明显调节作用的菊粉、水苏糖、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、两歧双歧杆菌等成分复合制备而成的益生菌剂对不同健康状态的受试人群加以干预，从调整菌群结构丰度水平、提高菌群多样性和改善肠道微生物与宿主平衡的角度出发，分析益生菌剂对肠道相关疾病的作用，为以肠道微生物为靶点的肠道疾病的预防提供理论依据，并提供新的思路。
1. 益生菌剂对肠道微生物多样性的影响分析
1.1 多样性指数分析
随着样品测序深度的增加，观测物种指数曲线趋于平缓，说明当前测序深度足以发现各样本生境中的大部分物种。此外，随着OTU等级的增加，曲线愈加平坦并且在横轴的跨度也越来越大，说明样品中物种的均匀度和相对丰度都达到了很高的水平。
1.2 益生菌剂干预下的肠道菌群多样性的变化
受试人群肠道菌群物种丰富度和微生物多样性，与CT组相比，3 组不同健康状态的受试人群肠道菌群的物种丰富度在益生菌剂干预后都有不同程度的增加，并且都向CT组靠近，说明益生菌剂干预对不同健康状态人群肠道菌群的多样性具有一定影响。
2. 益生菌剂对肠道菌群整体结构的影响
不同健康状况的受试人群肠道菌群结构中门水平相对丰度的差异较明显，从便秘组看，受试人群肠道菌群结构中Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria这3 种优势菌门有一个共同特点：在干预4 周后的菌群相对丰度分别为80.07%、12.48%、7.27%，与健康对照组（79.32%、13.75%、6.63%）最为接近，不同的是，Bacteroidetes的相对丰度随着益生菌剂的干预逐渐降低，由最初的84.27%降到44.78%；Firmicutes相对丰度在益生菌剂干预阶段虽略有波动，但是总体呈上升趋势；Proteobacteria相对丰度随益生菌剂干预时间的延长呈先降低后升高起伏波动状态。此外，Cyanobacteria和Fusobacteria的相对丰度与健康对照组（0.08%、0.005%）具有一定差异，但是，在益生菌剂干预第4周均从零上升到0.0017%，不过在益生菌剂停止干预后又恢复到了干预前的状态。对于腹泻组受试人群来说，益生菌剂对Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria有积极的调整作用，除Proteobacteria在干预4 周后由最初的3.08%调整到6.87%，与对照组（6.63%）最为接近外，其余两种均在干预停止后保持与对照组接近的84.17%、8.06%状态，同时，Fusobacteria在停止干预后异常升高至0.39%，远超对照组（0.005%）。就其他健康状况的受试人群来说，Bacteroidetes和Firmicutes在干预第4周分别调整到80.05%、14.65%，Proteobacteria和Actinobacteria在干预3周前分别由1.12%、0.03%升至4.94%、0.29%，与对照组（6.63%、0.21%）最为接近，但是，在停止干预后，Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria并没有保持不变而是呈现降低的趋势。此外，对排名前20的各个菌科在益生菌剂干预下的各个样品中相对丰度进行比较发现，Firmicutes的毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、韦荣球菌科（Veillonellaceae）、梭菌科（Clostridiaceae），Bacteroidetes的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae），Proteobacteria的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、产碱杆菌科（Alcaligenaceae）、弧菌科（Desulfovibrionaceae），以及Actinobacteria的双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）在科的水平上相对丰度占优势地位。
受试人群在益生菌剂的干预下，便秘组的Prevotellaceae、Lachnospiraceae、Alcaligenaceae、红蝽菌科（Coriobacteriaceae）及S24-7相对丰度在干预第4周后分别由0.23%、4.43%、2.58%、0.005%、0.03%增加至46.47%、6.50%、3.45%、0.1%、0.8%，停止干预后又降至22.01%、5.09%、3.28%、0.06%、0.29%；Bacteroidaceae、Desulfovibrionaceae和Rikenellaceae相对丰度分别由76.97%、0.085%、1.85%降至20.65%、0.023%、0.72%，停止干预后又升至50.75%、0.11%、0.83%。其中，Alcaligenaceae、Rikenellaceae、Coriobacteriaceae在向对照组（4.22%、0.58%、0 . 088%） 靠近。腹泻组中， 受试人群中Lachnospiraceae、Alcaligenaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、Coriobacteriaceae、Erysipelotrichaceae的菌群相对丰度从开始干预到第4周分别由1.87%、1.73%、0.12%、0.15%、0.05%、0.07%增至4.39%、4.46%、8.65%、0.55%、0.18%、0.23%；而Veillonellaceae经益生菌剂干预后由3 . 0 6%降至2.16%。其中，Lachnospiraceae、Alcaligenaceae、Erysipelotrichaceae、Veillonellaceae向对照组（5.49%、4.22%、0.24%、2.20%）状态调整，并且，Lachnospiraceae在干预停止后不会恢复至干预前的状态，仍保持在4.70%左右。就其他组受试患者菌群结构而言，在益生菌剂的作用下，除Veillonellaceae有下降的趋势外，Erysipelotrichaceae、Bifidobacteriaceae、Rikenellaceae、Odoribacteraceae、Desulfovibrionaceae、Coriobacteriaceae、S24-7都呈现增长的趋势，其中，Enterobact eriaceae、Bifidobacteriaceae、Rikenellaceae、Odoribacteraceae、Desulfovibrionaceae分别从干预前的0.19%、0.003 3%、0.32%、0.23%、0.17%提升至1.50%、0.19%、0.59%、0.38%、0.20%，接近于对照组相对丰度（1.49%、0.12%、0.58%、0.44%、0.28%）。
3. 关键菌属的鉴定
3 组受试人群在益生菌剂干预下共有20 个关键菌属存在显着差异（P＜0.05），其中，便秘组有5 个，包括拟杆菌属（Bacteroides）、柯林斯菌属（Collinsella）、巨单胞菌属（Megamonas）、Odoribacter、普氏菌属（Prevotella）；腹泻组有柔嫩梭菌属（Faecalibacterium） 、不动杆菌属（Acinetobacter）、布劳特氏菌属（Blautia）、梭菌属（Clostridium）、小类杆菌属（Dialister）、埃格特菌属（Eggerthella）、颗粒链菌属（Granulicatella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、草酸杆菌属（Oxalobacter）、Pyramidobacter等10 个，其他组有5 个，即Adlercreutzia、Collinsella 、克雷白氏杆菌属（Klebsiella） 、Parabacteroides和萨特氏菌属（Sutterella）。
4. 关键菌属对肠道菌群整体结构的影响
3 组不同健康状态样品均与健康对照组呈现交叠的状态，各组样品并不能完全分开，说明相较其他因素，益生菌剂对肠道菌群结构的调节作用较为明显。并且，3 组样品在X轴上的距离比较长。随着益生菌剂干预时间的延长，便秘组关键菌属由最初接近健康对照组逐渐沿着PC1（贡献率91.26%）、PC2（贡献率7.14%）拉开距离，在PC2方向尤为明显，但是距离健康对照组越来越远；腹泻组菌属则在益生菌剂干预第5周直至停止干预后沿PC1逐渐向对照组接近；其他组菌属在益生菌剂干预期间向健康对照组靠近，在停止干预后并没有继续保持这种状态。在PCA图中，各组样品随着益生菌剂干预的时长呈现调整状态，正是这种差异显着的状态，从另一层面上说明这20 个菌属可能是造成疾病组与健康对照组受试人群肠道菌群结构差异的关键菌属。
5. 关键菌属菌群相对丰度的变化
在益生菌剂的干预下，便秘组Bacteroides、Prevotella、Parabacteroides的变化明显且迅速，在干预第1周开始分别由最初的76.98%、0.23%、3.69%调整至22.18%、35.13%、18.7%，Megamonas由最初的0.005%逐渐向健康对照组（0.91%）调整，在第3周时达到1.06%，与对照组最为接近，Collinsella也在干预第3周开始出现；腹泻组Lactobacillus和Clostridium从无到有，并且，Clostridium在第1周就达到了0.06%，与健康对照组的相对丰度相同，Lactobacillus在第4周时达到0.006 7%，与健康对照组（0.0075%）最为接近；此外，益生菌剂具有升高Blautia降低Dialister和Faecalibacterium的作用，其中，Blautia由最初的0.0033%升至0.05%，并且，干预停止后并没有恢复至干预前的状态；就其他组而言，益生菌剂对5 种关键菌属具有升高的作用，Adlercreutzia在干预第1周从无到有，升高了0.005%，Collinsella、Klebsiella、Parabacteroides和Sutterella从干预开始至停止干预一直处于升高的趋势。
6. 益生菌剂对关键物种的影响
受试样品多以Bacteroides为核心菌属，说明肠型之说的存在。经益生菌剂干预，便秘组受试人群肠道中，玉米乳杆菌（Lactobacilluszeae）在干预第3周相对丰度达到最高（0.02%），超过健康对照组（0.01%）。Akkermansia muciniphila和两形真杆菌（Eubacterium biforme）在干预停止后的第2周相对丰度最高（0.42%、0.02%），脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、柔嫩梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）的相对丰度在第7周（16.17%、1.95%）及干预停止的第2周（11.6%、2.99%）较高，活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）在干预第4周及干预停止的第2周相对丰度升高，由最初的0.02%增至0.04%、0.08%；此外，卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）和Prevotellastercorea在干预前相对丰度最高，这说明益生菌剂具有降低二者相对丰度的作用。在腹泻组受试人群肠道菌群中，长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）和粪便拟杆菌（Bacteroides stercoris）在干预第6周（9.09%、0.33%）相对丰度最高，Actinobacillus parahaemolyticus和副流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）在干预第1周（0.12%、0.07%）时相对丰度增加明显，Anoxybacillus kestanbolensis的相对丰度由最初不存在到第4周（0.07%）最高，短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、Blautia producta及细长真杆菌（Eubacterium dolichum）都由最初不存在到停止干预后相对丰度达到最高（0.01%、0.03%、0.09%）。对于其他组，腹胀受试患者（A1_S6）的瘤胃乳酸杆菌（Lactobacillus ruminis）在益生菌剂干预第6周时相对丰度（0.12%）最高；肠易激综合征患者（I1_S1、I1_S2、I1_S4）及排便不规律患者（N1_S6）的Bacteroides coprophilus在第1～6周时开始出现。
结 论
所有测序序列在97%相似水平划分得到2320 个分类操作单元，拟杆菌门（Bacteroidetes）、硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）为各组的优势菌门，占总序列数的99.81%。益生菌剂对各组受试人群的共性特征是：毛螺菌科（Lachnospiraceae）的调整均有长期的积极作用，而产碱杆菌科（Alcaligenaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）等优势菌科在干预停止后又恢复至干预前的状态。益生菌剂对各种疾病状态人群的作用存在差异，便秘组的蓝细菌门（Cyanobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteria）均从无到有。经主成分分析（principal component analysis，PCA）鉴定显示，在干预第1～4周期间，益生菌剂对腹泻组属水平的调整优于其他两组，柔嫩梭菌属（Faecalibacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、布劳特氏菌属（Blautia）、梭菌属（Clostridium）、小类杆菌属（Dialister）、埃格特菌属（Eggerthella）、颗粒链菌属（Granulicatella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、草酸杆菌属（Oxalobacter）、Pyramidobacter等10 个属多样性及相对丰度均有明显的提升；便秘组仅有普氏菌属（Prevotella）、巨单胞菌属（Megamonas）、柯林斯菌属（Collinsella）3 个属相对丰度变化；其他组的Adlercreutzia、Collinsella、克雷白氏杆菌属（Klebsiella）、Parabacteroides、萨特氏菌属（Sutterella）5 个属有相对丰度的变化。PCA分析还揭示了益生菌剂在不同肠道疾病个体菌群结构的调整方面存在明显的差异，对不同肠道疾病的改善及治疗作用也不一样。另外，便秘组的Bacteroides和Odoribacter有降低的趋势，且回复到与对照组接近的状态。经热图分析鉴定发现，Akkermansia muciniphila、Bacteroides fragilis、Faecalibacterium prausnitzii等几种已被认定功效的关键菌阶段性地出现，但是停止干预后即消失，原有的Bacteroides ovatus开始降低，这些菌的出现对维护宿主健康具有价值。
