嗜热酶具有较高的酶促反应温度和较好的耐受性，已经成为酶制剂研发的重要领域。积极挖掘甘露聚糖酶资源，已成为研究的热点领域。近年来，果汁饮料在我国发展潜力巨大，而加工过程中出现的果汁浑浊制约着果汁产业的快速发展。甘露聚糖作为一种重要的半纤维素广泛地分布在水果中，而利用甘露聚糖酶提高果汁澄清相关报道较少，探究嗜热甘露聚糖酶作为果汁澄清用酶的潜力具有较强的理论和应用价值。
河北农业大学食品科技学院的陈伟、谷新晰和卢海强*等人拟对嗜热真菌Neosartorya sp. HBFH9中GH5家族甘露聚糖酶基因进行克隆、表达及相关酶学性质的研究，并探究其在果汁澄清中的应用潜力，这对丰富食品酶类资源及提高果汁加工质量具有一定的理论意义。
1.nsMan5B基因序列分析
经对菌株Neosartoryasp. HBFH9的GH5家族甘露聚糖酶保守序列扩增，共获得2 个180 bp左右的片段。经分析均属于GH5家族甘露聚糖酶，分别命名为nsMan5A和nsMan5B，基因nsMan5A序列与已报道的Man5P1一致性最高（99%），基因nsMan5B序列与Aspergillus fischeri NRRL 181中的XP_001262238.1一致性为99%，而到目前为止，并无该基因相关功能报道。经分析，nsMan5B基因由1 491 bp核苷酸组成，2 个内含子（I内含子950～1 009 bp，II内含子1 140～1 199 bp），cDNA全长1 371 bp核苷酸，编码456 个氨基酸和1 个终止密码子。理论分子质量约为49.5 kDa，等电点为5.0，该蛋白含有1 个信号肽序列（1-18 AA），不存在N-糖基化位点。经结构预测分析，成熟NsMan5B酶蛋白分子由3 部分组成：碳水化合物结合区（CBM1，1～30）、linker区（31～103）和催化区（104～423）。经序列比对分析（图1），nsMan5B基因序列与已报道的嗜热甘露聚糖酶ManBK基因序列（PDB：3wh9）一致性为46.7%,，与C.antarcticus中的甘露聚糖酶（PDB：4oou）基因序列一致性为12.7%，与Trichoderma reesei中甘露聚糖酶（PDB：1QNR）基因序列一致性为43.4%。经三维结构比对分析，NsMan5B具有典型的（β/α）8桶状结构，两个催化位点分别是281E和390E，属于GH5家族。
2.重组菌nsMan5B基因诱导表达及产物的SDS-PAGE分析
将重组菌株进行诱导表达之后，对细胞发酵液进行酶活检测，发酵液中酶活为7.8 U/mL。进一步对重组菌发酵液进行SDS-PAGE检测，结果见图2。发酵产物在约49 kDa处出现目标蛋白条带，这与NsMan5B酶蛋白分子理论分子质量基本上一致，不存在糖基化修饰。
3. 重组酶NsMan5B酶学特性分析
由图3A、C可知重组酶NsMan5B的最适反应温度为60 ℃，属于嗜热酶。在70 ℃反应下具有90%以上的酶活性，即使在90 ℃时依然能够维持50%以上活性，该酶的反应温度范围较广，30～90 ℃都能够检测到该酶的活性。在50 ℃条件下，重组酶NsMan5B酶基本稳定，在处理1 h后，能够维持80%以上的酶活性；60 ℃处理1 h后，酶活损失约50%；而70 ℃条件处理1 h后能够维持原活性的40%。
由图3B、D可知，重组酶NsMan5B具有较广的pH值作用范围，在pH 2.0～11.0范围内都表现出一定的酶活性，该酶的最适反应pH值为4.0，在酸性范围内（3.0＜pH＜7.0）酶活性较高，能够维持80%以上的酶活性。随着pH值的逐渐升高，酶活性也随之降低，直至pH 11.0，该酶活性完全丧失。
经对重组酶NsMan5B的酸碱耐受性分析发现，该酶在pH 2.0～11.0范围内处理1 h后酶活力基本维持稳定，即使在碱性条件下（7.0＜pH＜11.0）依然能够维持75%以上的酶活力，而在pH 12.0条件下处理后酶活力丧失较明显，只能维持原酶活性的20%左右。经动力学性质测定该酶的Vmax为76.3 μmol/（min·mg），Km为1.26 mg/mL。
4. 金属离子和化学试剂对重组酶活力的影响及动力学参数测定
结果显示，在低离子浓度（1 mmol/L）条件下，Zn2＋、Fe3＋和Cu2＋显着促进了重组酶NsMan5B的活性，使其活性分别提升了66%、32%和23%。除了Ca2＋和K＋对重组酶NsMan5B起到了较明显抑制外，其他金属离子都未对重组酶的活性表现出强烈抑制。而在高离子浓度条件下，除了Mn2＋外，其他金属离子都极显着的促进了重组酶NsMan5B的活性，其提升幅度从19%～244%不等。其中K＋和Cu2＋促进作用最为明显，分别使重组酶活性增加了2.4 倍和1.2 倍。不论是在高浓度还是低浓度，化学试剂并未同金属离子一样表现出明显的促进作用。
5. 重组甘露聚酶NsMan5B对5 种果汁澄清品质的影响
本研究用重组甘露聚糖酶NsMan5B分别处理柿子汁、苹果汁、桃子汁、葡萄汁和橘子汁。结果显示，重组酶除对橘子汁外，对其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中柿子汁最为明显，提高了31.8%，其他3 种果汁分别提高了7%、4%和4%。
讨 论
菌株Neosartorya sp.HBFH9为本课题组从中高温大曲中筛选获得，并初步确认为嗜热真菌（＞45 ℃）。通过对该菌基因组DNA中的GH5家族甘露聚糖酶保守序列的扩增，共获得2 条GH5家族的甘露聚糖酶基因的保守序列，分别命名为nsMan5A和nsMan5B基因。迄今为止并无nsMan5B基因功能的相关报道。经结构分析，NsMan5B酶蛋白分子的功能结构单元较完整，除具有催化功能的催化区外，还具有底物识别的碳水化合物结合区（CBM）和连接两功能结构单元的linker区。大量研究发现，linker区域对酶分子的稳定性有较大相关性，该区域的序列改造是后续提升重组NsMan5B稳定的重要靶点。重组酶NsMan5B却表现出较出色的pH值反应范围及较强的酸碱耐受特性。
本研究发现重组甘露聚糖酶NsMan5B同样对果汁的澄清有提升作用，而对不同品种果汁的澄清效果存在较大的差异，其中对柿子汁的效果最为明显，这很可能与果汁中的物质组成有很大关系。重组酶NsMan5B在柿子汁加工的应用潜力还需进一步挖掘，相关的技术参数还需进一步完善。
结 论
本研究成功从嗜热真菌Neosartoryasp. HBFH9获得嗜热甘露聚糖酶nsMan5B基因并进行了表达及相关性质的研究，结果表明重组甘露聚糖酶NsMan5B属于嗜热酶，具有较好的pH耐受性，在果汁的澄清中具有较好的应用效果。本研究不仅丰富了甘露聚糖酶资源，同时也为甘露聚糖酶在果汁加工中的应用提供了一定的理论指导。
